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文檔簡介
1、PI3K/AKT信號通路的激活可保護細胞免受外來刺激以維持機體穩(wěn)態(tài)的構建。ARC(apoptosis repressor with a caspase recruitment domain)是目前唯一一個已知的具有抗內源性以及外源性凋亡的蛋白,機體受不利因素刺激時其表達量增高;ARC蛋白的活化為高度分化的心肌,骨骼肌等終末細胞以及腫瘤細胞提供保護。目前,ARC發(fā)揮其保護作用的信號轉導機理仍然不清楚;PI3K/AKT信號通路是否介導ARC
2、發(fā)揮其生物學效應尚未有文獻報道,其相關作用機理有待進一步研究。通過體外培養(yǎng)原代雞胚心肌細胞,Hela以及293T細胞系;選擇不同濃度H2O2作用于三種細胞以建立體外氧化損傷模型;運用基因工程技術構建真核表達質粒P-IRES2-ARC-EGFP;轉染該質粒于原代雞胚心肌細胞、Hela以及293T細胞;運用CCK-8法以及PI染色法評估細胞活力以證實ARC的過表達是否保護細胞免受氧化損傷;Western blot檢測ARC、P-AKT以及P
3、53蛋白的表達;Real-Time PCR半定量PI3K、AKT以及P53基因的相對表達量;以此鑒定細胞氧化損傷模型下PI3K/AKT信號通路的激活以及相關基因的作用關系。應用PI3K阻斷劑LY294002抑制PI3K/AKT信號通路的激活證明在細胞氧化損傷模型下PI3K/AKT信號通路是否介導ARC保護細胞氧化損傷。結果顯示:原代雞胚心肌細胞、Hela細胞氧化損傷模型下PI3K以及AKT基因以及P-AKT蛋白呈現(xiàn)高表達;但293T細胞
4、P-AKT蛋白表達量不變;證明在原代雞胚心肌細胞、Hela細胞氧化損傷模型下PI3K/AKT信號通路的激活;抑制該信號通路明顯降低原代雞胚心肌細胞、Hela細胞活力;Hela以及293T細胞過表達ARC為其提供保護;但ARC的過表達未能保護原代雞胚心肌細胞氧化損傷;LY294002抑制PI3K/AKT信號通路的同時,ARC為Hela細胞提供保護;在293T細胞氧化損傷模型下,P53蛋白以依賴于H2O2作用劑量以及時間的形式呈現(xiàn)高表達,A
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