清熱活血解毒法調(diào)控HaCat細胞PI3K-Akt信號通路的機制研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的有遺傳背景并受環(huán)境、感染等多種因素影響的慢性復發(fā)性疾病。多數(shù)學者認為它是Th1-Th17軸占主導地位的自身免疫性系統(tǒng)性炎癥性疾病，可合并心血管疾病、糖尿病、代謝綜合征、抑郁及炎癥性腸病等。近年來有關銀屑病免疫發(fā)病機制的研究較多，其中免疫細胞、遺傳調(diào)控、相關炎癥分子之間的相互作用越來越受到重視，而信號傳導途徑的異?？赡茉谄渲衅鸬疥P鍵作用。
　　研究目的:
　　從信號通路傳導角度探討清熱活血解毒法（復方及中藥單

2、體）干預HaCat細胞的機制，研究清熱活血解毒法治療尋常型銀屑病的作用機制，明確其作用靶點。
　　研究方法:
　　應用TNF-α活化HaCat細胞24小時，再添加PI3K/Akt信號通路的特異性阻滯劑LY294002干預1小時，制備實驗所需的細胞模型。觀察清熱活血解毒復方及中藥單體落新婦苷對經(jīng)TNF-α活化的HaCat細胞的生物學行為影響，及PI3K/Akt信號通路對其的調(diào)控作用。包括采用CCK-8法檢測清熱活血解毒復方及落

3、新婦苷干預經(jīng)TNF-α活化的HaCat細胞的增殖情況;應用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)及RT-PCR檢測信號通路蛋白Akt及CREB的表達，以及凋亡基因bax、bcl-xl及c-fos的表達;采用流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析細胞各周期分布情況及細胞凋亡率;采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。
　　研究結果:
　　(1)清

4、熱活血解毒復方能夠抑制PI3K/Akt信號通路中Akt蛋白及基因的表達，并且在Akt蛋白的抑制中呈現(xiàn)劑量依賴;信號通路被阻滯后，抑制作用雖仍然存在，但與通路阻斷前相比，差異已無統(tǒng)計學意義。同時，清熱活血解毒復方對CREB蛋白及基因的表達均有明顯抑制作用，且隨著劑量的增加而增強，尤其是在應用高劑量(30mg/ml)時;信號通路被阻滯后，復方對CREB的抑制作用較阻斷前有所減弱。
　　清熱活血解毒復方對經(jīng)TNF-α活化的HaCat細胞

5、具有良好的抑制增殖作用;在信號通路被阻斷后，細胞的增殖繼續(xù)受到抑制。清熱活血解毒復方對TNF-α活化的HaCat細胞凋亡的影響主要表現(xiàn)在促進其早期凋亡;通路被阻斷后，復方可使HaCat細胞的早期凋亡率繼續(xù)上升，晚期凋亡率下降。清熱活血解毒復方可使HaCat細胞大量阻滯于S期而無法進入有絲分裂期，從而發(fā)揮其抑制HaCat細胞增殖的作用;在通路被阻斷后，復方使HaCat細胞G0/G1期所占比重增加，S期下降。
　　清熱活血解毒復方可上

6、調(diào)bax的表達，并且該上調(diào)作用與復方劑量呈現(xiàn)依賴性;在通路被阻斷后，復方對bax的上調(diào)能力受到影響，這種影響在高劑量組中表現(xiàn)的尤為突出。清熱活血解毒復方可降低TNF-α活化的HaCat細胞中bcl-xl的表達;在通路被阻斷后，復方的下調(diào)作用較之阻斷前有所加強。清熱活血解毒復方可降低TNF-α活化的HaCat細胞中c-fos的表達，而且下調(diào)作用與復方劑量相關;在通路被阻斷后，復方對于c-fos蛋白的表達在阻滯前后無明顯變化。
　　清

7、熱活血解毒復方能夠抑制HaCat細胞中IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。PI3K/Akt信號通路在這些炎癥因子的分泌中均起到調(diào)節(jié)作用，同時在復方抑制HaCat細胞分泌IFN-γ、IL-1β及IL-6的作用存在密切的聯(lián)系，而在IL-8的分泌上則未表現(xiàn)出明顯的相關性。
　　(2)落新婦苷可以抑制經(jīng)TNF-α活化的HaCat細胞中Akt的表達，抑制作用隨劑量的增加而增強，并在Akt蛋白的抑制上呈現(xiàn)劑量依賴;在阻滯通路后，

8、落新婦苷對Akt的表達較阻滯前有所減弱。落新婦苷對CREB則有較好的抑制作用，在CREB蛋白的抑制上呈現(xiàn)劑量依賴;在阻斷通路后，落新婦苷對CREB的抑制作用較阻斷前相比繼續(xù)增強。
　　落新婦苷能夠抑制經(jīng)TNF-α活化的HaCat細胞的增殖，且抑制作用隨著劑量的增加而增強;在阻斷PI3K/Akt通路后，落新婦苷的抑制增殖作用較前減弱，但隨著時間的推移，落新婦苷的抑制增殖作用比未阻斷通路時增強。落新婦苷可使經(jīng)TNF-α活化的HaCat

9、細胞S期的細胞數(shù)量增多，G0/G1期及G2/M期的細胞數(shù)量同時減少;在通路被阻滯后，落新婦苷使HaCat細胞G0/G1期與G2/M期的細胞數(shù)量持續(xù)減少，S期細胞數(shù)量持續(xù)增加。
　　落新婦苷在經(jīng)TNF-α活化的HaCat細胞中對bax具有上調(diào)作用，該作用隨劑量的增加而增強;在通路被阻斷后，上調(diào)作用較阻斷前有所增強。面對bcl-xl的表達，落新婦苷則有抑制作用，同樣在阻斷通路后，該抑制作用有所加強。落新婦苷對原癌基因c-fos的表達有

10、明顯的抑制作用;在通路被阻斷后，落新婦昔對c-fos的干預作用較阻斷前有所減弱。
　　落新婦苷可以抑制HaCat細胞分泌IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的水平，并且對于前三種細胞因子的抑制作用隨著劑量的增加而增強，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。PI3K/Akt信號通路在除落新婦苷對IL-1β的干預有較為密切的關系以外，對其他細胞因子IFN-γ、IL-6及IL-8的干預均未表現(xiàn)出明顯的相關性。
　　研究結論:
　　P