腹透液相關(guān)濃度葡萄糖對人腹膜間皮細(xì)胞周期蛋白的影響及葛根素的拮抗作用

1、<p>　　腹透液相關(guān)濃度葡萄糖對人腹膜間皮細(xì)胞周期蛋白的影響及葛根素的拮抗作用</p><p>　　【摘要】 目的 研究腹透液相關(guān)濃度葡萄糖（1.5％、2.5％）對人腹膜間皮細(xì)胞周期和周期蛋白p21的影響及葛根素的拮抗作用。方法 人腹膜間皮細(xì)胞在含糖（1.5％、2.5％）、含糖含葛根素(葛根素終濃度為100 mg/L)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期,Western blot

2、測定p21蛋白的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)含糖1.5％和含糖2.5％培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后人腹膜間皮細(xì)胞大多出現(xiàn)肥大和停滯于細(xì)胞周期的G1期。高濃度葡萄糖刺激p21蛋白表達(dá),含糖2.5％組和含糖1.5％組無顯著性差異(P&gt;0.05)。含葛根素含糖組腹膜間皮細(xì)胞中處于G1期細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)濃度含糖組減少，p21表達(dá)減少(P&lt;0.05)。結(jié)論 高糖可刺激人腹膜間皮細(xì)胞p21蛋白的表達(dá),且可能與高糖作用下細(xì)胞肥大及G1期阻滯有關(guān)，葛

3、根素可在一定程度上拮抗高糖對人腹膜間皮細(xì)胞周期和周期蛋白的影響。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 腹膜間皮細(xì)胞;葡萄糖;細(xì)胞周期蛋白；葛根素 </p><p>　　Abstract: Objective To investigate the effect of glucose at different concentrations on the cell cycle and p21

4、 expression in cultured human peritoneal mesothelial cells (HPMC) and protection of puerarin. Methods HPMCs were cultured with serum free RPMI 1640 medium containing glucose of different concentrations (1.5% and 2.5%) a

5、nd puerarin (100 mg/L) for 24 hours. The cell cycle distribution was then investigated by flow cytometry. The expression of p21 was detected by Western blot. Results In</p><p>　　Key words: peritoneal mesoth

6、elial cells; glucose; cyclin; puerarin </p><p>　　腹膜纖維化所致的腹膜功能衰竭是腹膜透析應(yīng)用受限的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)高糖可使間皮細(xì)胞肥大,間皮細(xì)胞層受損或缺失,導(dǎo)致腹膜纖維化和功能喪失［1］,有效保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞能延緩腹膜纖維化。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21過度表達(dá)與細(xì)胞肥大有關(guān)［2-3］。葛根素能拮抗腹膜透析液對腹膜間皮細(xì)胞的損傷,發(fā)揮抗纖維化作用［4］。本實(shí)驗(yàn)觀察高

7、濃度葡萄糖對人腹膜間皮細(xì)胞周期和p21蛋白的影響及葛根素的拮抗作用,從細(xì)胞周期和周期蛋白角度探討葛根素抗腹膜纖維化的分子機(jī)制。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 含糖腹膜透析液購于廣州百特公司,葛根素為浙江康恩貝制藥股份公司產(chǎn)品,血清、RPMI1640粉劑、胰酶購自GBCO公司,抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗波形蛋白

8、抗體、抗第八因子抗體和抗白細(xì)胞CD45抗體、抗p21抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司,流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。 </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 人腹膜間皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 取非尿毒癥和糖尿病擇期手術(shù)患者的網(wǎng)膜作為細(xì)胞來源,按文獻(xiàn)［5］法培養(yǎng)間皮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長融合時用胰酶消

9、化,按1∶3傳代,第3代用于實(shí)驗(yàn)。經(jīng)倒置顯微鏡觀察和免疫組化抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體染色陽性,抗第八因子抗體和抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性鑒定。 </p><p>　　1.2.2 間皮細(xì)胞分組及在不同條件下的形態(tài)觀察 將融合后的腹膜間皮細(xì)胞消化后接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)至亞融合后加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基,同步化培養(yǎng)24 h后分別加入含不同濃度葡萄糖（1.5%、2.5%）和（或）葛根素(葛根素終

10、濃度為100 mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)分對照組（不含糖不含葛根素）、含糖1.5％組、含糖2.5％組及葛根素組、含葛根素含糖1.5％組、含葛根素含糖2.5％組6組。 </p><p>　　1.2.3 流式細(xì)胞儀分析各組間皮細(xì)胞的周期分布 腹膜間皮細(xì)胞在不同條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后用PBS液洗2次，胰酶消化，70%乙醇固定后，重懸于PBS液中。加入RNA酶50 mg/L

11、,避光30 min離心去上清液。碘化吡啶于暗處染色30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測，得到細(xì)胞周期各時相百分比。 </p><p>　　1.2.4 Western blot檢測不同濃度葡萄糖及葛根素作用下間皮細(xì)胞的周期蛋白 用RAPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取40 μg樣品經(jīng)煮沸5 min后進(jìn)行10%、15%的SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，膜在室溫封閉4 h，加1∶100抗p

12、21抗體，4℃過夜，后加二抗室溫作用1 h，洗膜后顯色。 </p><p>　　1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用±s表示，用SPSS 12．0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組腹膜間皮細(xì)胞p21表達(dá)的比較采用單因素方差分析，P&lt;0.05表示存在顯著性差異。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p><p&

13、gt;　　2.1 各組人腹膜間皮細(xì)胞周期的比較 對照組培養(yǎng)24 h的間皮細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例為（62.5±3.3）%,而含糖1.5％組和含糖2.5％組G1期細(xì)胞比例增高,分別為（72.1±3.54）%和（72.5±3.4）%，與對照組有顯著性差異(P&lt;0.05)，含糖2.5％組和含糖1.5％組無顯著性差異（P＞0.05）。含葛根素含糖1.5％組和含葛根素含糖2.5％組G1期細(xì)胞比例分別為（

14、64.7±4.5）%和（65.6±4.3）%,與對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）。 </p><p>　　2.2 各組人腹膜間皮細(xì)胞p21的表達(dá) 圖1可見，對照組腹膜間皮細(xì)胞p21表達(dá)少,含糖1.5％組和含糖2.5％組與對照組比較p21表達(dá)增多（P＜0.05）,其中含糖2.5％組與含糖1.5％組無顯著性差異（P＞0.05）。含葛根素含糖組較相應(yīng)濃度含糖組p21表達(dá)減少（P&l

15、t;0.05）。 </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　腹膜透析作為有效的腎臟替代治療方法已經(jīng)被越來越多的尿毒癥患者所接受,腹膜發(fā)生纖維化導(dǎo)致腹膜功能衰竭是患者退出治療的主要原因之一。含糖的腹膜透析液具有明顯的生物不相容性,其導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是腹膜纖維化的關(guān)鍵因素［6］。有效保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞可明顯延緩腹膜纖維化的進(jìn)程。

16、</p><p>　　在長期腹膜透析過程中腹膜間皮細(xì)胞可因持續(xù)暴露于高糖腹膜透析液中而出現(xiàn)細(xì)胞肥大、細(xì)胞分裂停滯等表現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖促使間皮細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的G1期。目前認(rèn)為細(xì)胞肥大可能是由于細(xì)胞受細(xì)胞內(nèi)外信號刺激后進(jìn)入G1期時,DNA合成被抑制，同時蛋白和RNA 合成增加,細(xì)胞生長停滯于G1期所致［7］。細(xì)胞周期抑制蛋白p21能廣泛抑制G1期和S期的周期素與細(xì)胞周期激酶結(jié)合,使G1期過度延

17、長,細(xì)胞增殖抑制,細(xì)胞呈肥大狀態(tài)。 </p><p>　　研究表明葛根素可以通過抑制氧化應(yīng)激對腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用［4］，但葛根素可否拮抗高糖對人腹膜間皮細(xì)胞周期和周期蛋白的影響尚不明確。我們檢測不同濃度葡萄糖對腹膜間皮細(xì)胞p21表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可刺激腹膜間皮細(xì)胞p21的表達(dá)，而含糖含葛根素組細(xì)胞較相應(yīng)濃度含糖組p21表達(dá)減少。本研究提示高糖狀態(tài)下間皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變可能與細(xì)胞周期的調(diào)控失衡有關(guān)，

18、葛根素可拮抗上述影響，此結(jié)果為葛根素抗腹膜纖維化的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。 </p><p>　　綜上所述，高糖可使腹膜間皮細(xì)胞停滯于G1期，可刺激腹膜間皮細(xì)胞p21蛋白的表達(dá),葛根素可在一定程度上拮抗高糖對間皮細(xì)胞周期和周期蛋白的影響。由此推測,葛根素可能通過拮抗高糖對間皮細(xì)胞周期和周期蛋白的影響而保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞,從而發(fā)揮抗腹膜纖維化的作用。 </p><p><b>　　【參

19、考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ Gotloib L, Shostak A, Wajsbrot V, et al. High glucose induced a hypertrophic, senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure ［J］. Nephron,1999,82(2):164-173. &l

20、t;/p><p>　?。?］ Shankland SJ. Cell cycle control and renal disease ［J］. Kidney Int,1997,52(2):294-308. </p><p>　　［3］ Kuan CJ, al-Douahji M, Shankland SJ. The cyclin kinase inhibitor p21WAF1, CIPl is

21、 increased in experimental diabetic nephropathy: potential role in glomerular hypertrophy ［J］. J Am Soc Nephrol,1998,9(6):986-993. </p><p>　　［4］ 蔣春明，張 苗，孫 諍.葛根素對體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2007,26(3):18

22、5-188. </p><p>　?。?］ Stylianou E, Jenner LA, Davies M, et al. Isolation, culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells ［J］. Kidney Int,1990,37(6):1563-1570. </p><p>　?。?］ Po

23、llock C. Pathogenesis of peritoneal sclerosis ［J］. Int J Artif Organs,2005,28(2):90-96. </p><p>　　［7］ Shankland SJ. Cell cycle regulatory proteins in glomerular disease ［J］. Kidney Int,1999,56(4):1208-1215.&