白細(xì)胞介素34調(diào)控成骨細(xì)胞表達(dá)破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子及作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　正畸治療的關(guān)鍵在于牙槽骨的改建，在這個(gè)過程中，成熟的破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)是行使骨吸收功能的重要細(xì)胞，而OC的分化及成熟主要受成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）的調(diào)控。在多種理化因素，如機(jī)械力、細(xì)胞因子、化學(xué)因子等的作用下，OB可以表達(dá)多種OC分化相關(guān)因子，如PGE2(prostaglandinE2)'RANKL(receptor activator ofNF-κB ligand,RANKL), M

2、-CSF(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF), OPG(osteoprotegrin, OPG), IL（interleukin，IL）-1，IL-6和TNF-α稱為OC分化相關(guān)因子，其中尤以RANKL和M-CSF最為關(guān)鍵。RANKL可以和OC上的相應(yīng)受體-RANKL(receptor activatorof nuclear factor kappa B，RANK)結(jié)合，促進(jìn)OC分化、活化

3、。此外，OB還分泌OPG，做為“餌受體”高度特異性與RANK結(jié)合，抑制RANKL的作用，抑制OC分化，促進(jìn)OC凋亡。因此，RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)被認(rèn)為是近年發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)骨吸收的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路。
　　IL-34是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其與多種炎癥疾病及骨丟失疾病相關(guān)，體外研究表明IL-34可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞向OC分化。IL-34可促進(jìn)入外周血細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-17及化學(xué)趨化因子等。作為最新發(fā)現(xiàn)的骨

4、吸收炎性因子，IL-34參與骨性疾病的發(fā)病過程中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎等。研究發(fā)現(xiàn)IL-34與M-CSF共用同一受體CSF1R(colony stimulating factor-1receptor，CSF1R)，可以聯(lián)合RANKL促進(jìn)OC的分化及成熟。IL-34在骨吸收過程中的重要作用正不斷被發(fā)現(xiàn)，OB是調(diào)控OC分化的重要細(xì)胞，而關(guān)于IL-34與OB之間的相互作用尚未見報(bào)道。
　　在正畸牙移動(dòng)過程中，齦溝液內(nèi)PGE2的表達(dá)水

5、平較高。PGE2可促進(jìn)OC分化和骨吸收，并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是骨重建過程中一個(gè)重要因素。IL-17作為一種促炎因子可以通過調(diào)控PGE2影響OB表達(dá)OC分泌相關(guān)因子，而在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，IL-34與IL-17關(guān)系密切，因此我們假設(shè)IL-34可能通過IL-17調(diào)控OB和OC分化及功能，參與牙槽骨的代謝。
　　本研究通過檢測(cè)IL-17、IL-34對(duì)OB增殖能力、表達(dá)OC分化因子的影響，探討IL-34在調(diào)控骨代謝過程的作用，為進(jìn)一步揭

6、示牙槽骨改建及正畸牙移動(dòng)的具體分子機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　選擇新生小鼠顱骨細(xì)胞系MC3T3-E1作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，細(xì)胞按2.0×104cells/cm2密度接種于96孔板，用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)。用含50mM磷酸甘油和50μM/ml抗壞血酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)20天，采用固定液（4％甲醛磷酸鹽緩沖液）固定15分鐘，沖洗:采用飽和的茜紅素染色10分鐘，PBS沖洗15分鐘，染色鮮紅的部位即代表鈣化結(jié)節(jié)。
　

7、　以2.0×104cells/cm2的密度將MC3T3-E1細(xì)胞接種于100mm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合80％，換用含1％FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12h后，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
　　一、加入不同濃度IL-17(0、0.1、1、10ng/mL)，刺激0h、24h、48h、72h后，CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，RT-PCR檢測(cè)RANKL、OPG mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)RANKL、OPG和PGE2蛋白表達(dá)。

8、
　　二、加入不同濃度IL-34(0、10、50、100ng/mL)，刺激0h、24h、48h、72h后，CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，RT-PCR檢測(cè)RANKL、OPG mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)RANKL、OPG和PGE2蛋白表達(dá)。
　　三、加入IL-17（10ng/mL）和IL-34(100ng/mL)刺激0、24h、48h、72h后，CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，RT-

9、PCR檢測(cè)RANKL、OPG mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)RANKL、OPG和PGE2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一、MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)經(jīng)骨向誘導(dǎo)劑刺激可以形成鈣結(jié)節(jié)。
　　二、IL-17、IL-34顯著抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力，并顯著增加MC3T3-E1細(xì)胞G0/G1期比例，減少G2/M期比例。IL-17、IL-34聯(lián)合作用時(shí)，效果最為顯著。
　　三、IL-17、IL-34顯著促進(jìn)MC3T3

10、-E1細(xì)胞在mRNA和蛋白水平RANKL的表達(dá)，顯著抑制mRNA和蛋白水平上OPG的表達(dá)。IL-17、IL-34聯(lián)合作用時(shí)，效果最為顯著。
　　四、IL-17、IL-34顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞PGE2蛋白的表達(dá)。IL-17、IL-34聯(lián)合作用時(shí)，效果最為顯著。
　　結(jié)論：
　　一、IL-17、IL-34在體外實(shí)驗(yàn)中可以顯著抑制MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力，并顯著影響細(xì)胞周期的分布，揭示IL-17、IL-34可能