白細胞介素1β對骨髓中性粒細胞與嗜酸性粒細胞分化的調(diào)控及其相關(guān)機制.pdf

1、哮喘是由多種細胞及細胞組分，包括嗜酸性粒細胞(Eos)、中性粒細胞(Neut)、淋巴細胞、肥大細胞等炎癥細胞及炎癥介質(zhì)、細胞因子等所形成的氣道內(nèi)炎癥細胞浸潤、黏液分泌增多、氣道高反應(yīng)性(AHR)、成纖維細胞及上皮細胞增生、平滑肌細胞肥大及氣道重塑，其本質(zhì)是一種慢性氣道炎癥。一直以來，多項研究發(fā)現(xiàn)哮喘是以Th2細胞反應(yīng)為主的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥，對激素治療效果明顯，而臨床上發(fā)現(xiàn)以中性粒細胞性氣道炎癥為主的哮喘患者對激素治療效果不明顯，甚

2、至出現(xiàn)惡化的表現(xiàn)，這部分哮喘又稱之為中性粒細胞性哮喘，即難治性哮喘、重癥哮喘。由此可見，氣道嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤在哮喘的病理生理過程及臨床癥狀的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，阻斷氣道嗜酸性粒細胞及中性粒細胞性炎癥對哮喘的治療有決定性意義。
　　白細胞介素1β(IL-1β)是IL-1家族的成員之一，作為一種重要的前炎癥因子參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。多項研究發(fā)現(xiàn)IL-1β在哮喘尤其是重癥哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用，而且與氣道內(nèi)嗜酸性粒細

3、胞及中性粒細胞的升高密切相關(guān)，盡管其機制并不明確。甚至臨床研究認為IL-1β可以作為區(qū)別哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的生物學(xué)標(biāo)記。另外，有文獻報道IL-1β干預(yù)后可以引起骨髓造血干祖細胞向髓系的分化，由此我們假設(shè)IL-1β是否可以直接參與骨髓造血干祖細胞向Neut及Eos分化的調(diào)控，從而為IL-1β在哮喘發(fā)病機制的探究做鋪墊，開拓新的視野，為哮喘的臨床治療提供新的防治靶點。
　　目的:探討IL-1β對骨髓造血干祖細胞向中性粒

4、細胞和嗜酸性粒細胞分化的調(diào)控及其相關(guān)機制，從而為IL-1β在哮喘的發(fā)病機制提供新的理論契機。
　　方法:健康同周齡WT小鼠與IL-1R敲除（IL-1 R-/-）小鼠，分為四組:WT小鼠生理鹽水對照組（WT-NS組），WT小鼠LPS模型組（WT-LPS組），IL-1R-/-小鼠生理鹽水對照組（IL-1R-/--NS組）及IL-1R-/-小鼠LPS模型組（IL-1R-/--LPS組）。氣道滴注脂多糖(LPS)（1mg/kg小鼠）或者生

5、理鹽水(NS)，24小時內(nèi)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中性粒細胞比例;流式細胞術(shù)檢測和分析骨髓中性粒細胞(Gr-1+CD11b+)，并進一步分析原始中性粒細胞(Pro/mye，Gr-1intCD11bint)，非成熟中性粒細胞(imNeut，Gr-1hiCD11blo)及成熟中性粒細胞(mNeut，Gr-1hiCD11bhi)這三群細胞的比例。其中原始中性粒細胞(Pro/mye)包括原幼粒細胞和中幼粒細胞，非成熟中性粒細胞(

6、imNeut)包括晚幼粒細胞和桿狀粒中性粒細胞，成熟中性粒細胞(mNeut)即分葉核中性粒細胞。利用IL-1R-/-小鼠與WT小鼠構(gòu)建骨髓移植及Neut炎癥模型:健康C57BL/6雌鼠作為受體鼠先接受化療，腹腔注射白消胺(BU)，30mg/kg，每日1次，連續(xù)4天，腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，50mg/kg，每日1次，連續(xù)2天，中間休息1天后，第8天，提取同周齡的供體鼠（IL-1R-/-雄鼠與WT雄鼠）的骨髓細胞，按2-4×107cel

7、ls/小鼠為受體雌鼠進行尾靜脈注射，待第21天受體鼠骨髓造血系統(tǒng)基本恢復(fù)進行造模，隨機分為四組:WT小鼠回輸生理鹽水對照組（WT-WT-NS組）、WT小鼠回輸LPS模型組(WT-WT-LPS組)、敲除小鼠回輸生理鹽水對照組（IL-1R-/--WT-NS組）、敲除小鼠回輸LPS模型組（IL-1R-/--WT-LPS組），氣道滴注NS及LPS（1ug/g小鼠）24時內(nèi)進行模型處理，檢測方法同上。體外Neut克隆形成實驗檢測IL-1β對Neu

8、t分化的影響，液態(tài)培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓Neut分化并流式檢測Neut、AnnexinⅤ/PI、E.coli吞噬等進一步研究IL-1β干預(yù)對Neut分化、凋亡及功能的影響。實時定量PCR(Q-PCR)檢測骨髓Neut分化過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表達。同時，體外半固態(tài)及液態(tài)培養(yǎng)檢測IL-1β對嗜酸性粒細胞(Eos)分化的影響:Eos半固態(tài)克隆形成實驗檢測并比較對照組（IL-5）及實驗組(I

9、L-5+IL-1β)Eos的克隆形成情況;流式檢測液態(tài)誘導(dǎo)Eos分化過程中IL-5和或IL-1β干預(yù)后Eos的(SiglecF+)水平，并利用BrdU方法檢測Eos增殖及凋亡水平;Q-PCR檢測Eos分化過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-1及重要調(diào)控分子MBP-1的表達。
　　結(jié)果:在Neut炎癥模型中，與WT-LPS組相比，IL-1R-/-LPS組BALF-Neut總數(shù)有下降趨勢，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，P=0.0571)，

10、外周血Neut比例明顯降低(P＜0.05)，骨髓Pro/mye比例無明顯變化(P＞0.05)，但是骨髓imNeut比例明顯增加(P＜0.05)，mNeut比例明顯降低(P＜0.001)。利用IL-1R-/-小鼠與WT小鼠進行骨髓移植并構(gòu)建Neut炎癥模型，比較IL-1R-/-WT-LPS組與WT-WT-LPS組，前者BALF-Neut比例有下降趨勢，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，P=0.0503)，外周血Neut炎癥明顯緩解(P＜0

11、.01)，骨髓Pro/mye比例無明顯變化(P＞0.05)，骨髓imNeut比例變化也不明顯(P＞0.05)，而mNeut比例明顯降低(P＜0.001)。中性粒細胞體外誘導(dǎo)分化液態(tài)培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β單獨干預(yù)對Neut的分化無明顯影響(P＞0.05)，而在G-CSF的協(xié)同作用下可以明顯促進Neut的分化(P＜0.001)，但對Neut凋亡抑制作用不明顯(P＞0.05)，并對Neut吞噬功能也有一定的促進作用(P＜0.05)。體外半固

12、態(tài)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，IL-1β在G-CSF協(xié)同的作用下明顯促進Neut-CFU的形成(P＜0.01)。Q-PCR檢測Neut分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與WT-NS組相比，WT-LPS組G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表達水平升高(P＜0.05)，而IL-1R-/--LPS組骨髓G-CSFR、 C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表達水平與IL-1R-/-NS組比較則無明顯變化(P＜0.05)。嗜酸性

13、粒細胞體外半固態(tài)及液態(tài)培養(yǎng)結(jié)果:Eos半固態(tài)克隆形成實驗結(jié)果顯示實驗組(IL-5)Eo-CFU數(shù)量與對照組（IL-5）相比無明顯變化(P＞0.05);Eos液態(tài)培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，第8-10天收集細胞流式檢測Eos分化水平及凋亡情況，結(jié)果顯示在IL-5的作用下，Eos逐漸分化成熟，但IL-1β干預(yù)后并不影響Eos的分化(P＞0.05)，且實驗組與對照組中Eos相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1)及重要調(diào)控蛋白(MBP-1)的mRNA表達也無明顯差別(

14、P＞0.05)。Eos液態(tài)培養(yǎng)第10天進行BrdU流式檢測發(fā)現(xiàn)，盡管實驗組與對照組相比S期細胞比例無明顯差別，但凋亡細胞群卻明顯減少。
　　結(jié)論:IL-1β在G-CSF協(xié)同作用下明顯促進Neut的分化，這一作用可能是通過上調(diào)G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的表達而實現(xiàn)，而單獨作用影響不明顯。同時，IL-1β還能促進Neut的吞噬功能，但對其凋亡無明顯影響。另外，IL-1β不影響骨髓Eos的分化與增殖，但是能抑制E