牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨前體細(xì)胞成骨分化和破骨前體細(xì)胞破骨分化影響研究.pdf

1、目的：
　　牙周病治療的最終目標(biāo)是能夠消除牙周組織局部的炎癥，再生和重建具有結(jié)構(gòu)學(xué)和功能學(xué)意義的牙周膜、牙骨質(zhì)和骨組織。然而由于牙周疾病病因?qū)W和口腔微環(huán)境極其復(fù)雜和特殊，目前還沒有療效滿意的治療方法。近些年來，基于干細(xì)胞技術(shù)的組織工程方法為牙周組織再生和重建提供了新的思路和方法。種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是傳統(tǒng)的組織工程學(xué)研究領(lǐng)域主要的研究內(nèi)容，其中，尋找來源豐富、取材方便、具有增殖分化潛能的種子細(xì)胞是目前組織再生醫(yī)學(xué)研究中的熱

2、點(diǎn)。
　　目前用于牙周再生研究中的干細(xì)胞主要牙源性和非牙源性兩大類。牙源性干細(xì)胞的來源包括牙周膜(34)，人類脫落的乳牙(5)，根尖部的牙乳頭(6)，牙囊組織(7)及牙髓組織(8)。非牙源性干細(xì)胞主要有骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stemcells，BMSCs)和脂肪干細(xì)胞。其中，來源于牙周膜的干細(xì)胞(periodontalligament stem cells，PDLSCs)是牙周再生研究中應(yīng)用最多的細(xì)胞之一。甚至有

3、學(xué)者認(rèn)為PDLSCs優(yōu)于BMSCs(16)和其他牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞，將PDLCs應(yīng)用于牙周組織再生可能會(huì)更具有臨床實(shí)際意義。
　　在牙周組織的再生中，牙槽骨的再生至關(guān)重要。牙槽骨在牙周組織中是一個(gè)代謝活躍的器官，在整個(gè)生命周期中都在進(jìn)行不斷的更新和改建。其形態(tài)發(fā)生和重建由兩個(gè)對(duì)立統(tǒng)一的過程所控制:成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)介導(dǎo)的骨基質(zhì)合成和破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)介導(dǎo)的骨吸收過程。一般認(rèn)為，作為種子細(xì)胞的

4、牙周膜干細(xì)胞修復(fù)骨組織缺損的作用主要是利用牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化能力。但其通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸或通過旁分泌細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體自身其他細(xì)胞的影響亦被認(rèn)為是促進(jìn)牙周再生的重要機(jī)制。牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。
　　本研究過體外分離純化培養(yǎng)PDLSCs，并將PDLCs分別與成骨前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞共培養(yǎng)，探討PDLCs對(duì)成骨前體細(xì)胞成骨分化及破骨前體細(xì)胞破骨分化的影響作用，進(jìn)一步豐富PDLC

5、s在牙周組織工程中的作用機(jī)制，并為完善牙周組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　1.1 PDLSCs的分離培養(yǎng)
　　利用酶消化和組織塊混合培養(yǎng)法從臨床阻生拔除的第三磨牙和因正畸需要拔除的健康前磨牙（牙根已發(fā)育完成）的牙周膜中獲得原代細(xì)胞，消化傳代后，取P3-P5的細(xì)胞供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。利用有限稀釋法，挑取單克隆獲得具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞PDLSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

6、r>　　1.2 干細(xì)胞特性及多向分化能力鑒定
　　分別對(duì)分離純化的PDLSCs進(jìn)行克隆形成率(CFU-F)分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)。在體外以0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，50 mg/ml維生素C-二磷酸鹽誘導(dǎo)PDLSCs向成骨細(xì)胞分化，茜素紅染色法檢測鈣化結(jié)節(jié)的形成;以0.1μ M地塞米松，60μ M吲哚美辛，50 mg/ml維生素C-二磷酸鹽分別誘導(dǎo)PDLSCs向脂肪細(xì)胞分化并用油紅O(Oil Red

7、O)染色檢測脂肪滴的形成。
　　2.牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨前體細(xì)胞成骨分化作用研究
　　本實(shí)驗(yàn)利用分離純化的PDLSCs，將牙周膜干細(xì)胞與成骨細(xì)胞前體細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子ALP，BSP，OPN的mRNA表達(dá)及BSP，OPN蛋白的表達(dá)水平，并觀察成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況。分析牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。
　　3.牙周膜干細(xì)胞對(duì)破骨前體細(xì)胞破骨分化作用研究
　　由于破骨細(xì)胞是分化終末細(xì)胞，所以將PD

8、LSCs與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并計(jì)數(shù)，檢測Cathepsin K(CSTK)，TRAF6,TRAP等破骨細(xì)胞標(biāo)志mRNA及TRAF6,TRAP蛋白的表達(dá)水平，觀察PDLSCs對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　PDLSCs原代培養(yǎng)3天后，倒置顯微鏡觀察可見分散的細(xì)胞貼壁伸展，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到瓶底的70％-80％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。PDLSCs在體外呈集落

9、樣增殖，克隆形成率分析(CFU-F)結(jié)果顯示，PDLSCs的克隆形成能力高。用有限稀釋法獲得成纖維細(xì)胞集落克隆形成單位，將單個(gè)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得具有自我更新能力的人PDLSCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記顯示，該細(xì)胞表達(dá)CD29、CD105、CD90、STRO-1,而不表達(dá)CD34、CD45。PDLSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4周后，經(jīng)茜素紅染色后均能觀察到大小不一的紅染的礦化結(jié)節(jié)，PDLSCs向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)2周后，經(jīng)油紅O染色，可

10、見有紅色脂肪小滴形成。
　　2.牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨前體細(xì)胞成骨分化的作用
　　2.1 PDLSCs增加了MC3T3-E1 ALP活性
　　ALP活性是成骨細(xì)胞早期分化的一個(gè)特征性標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)與PDLSCs的MC3T3-E1共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組和僅有MC3T3-E1培養(yǎng)的對(duì)照組，在第7天和第14天時(shí)分別測定MC3T3-E1的ALP活性，結(jié)果顯示有PDLSCs存在的共培養(yǎng)體系中MC3T3-E1的ALP活性顯著增加。
　　

11、2.2 PDLSCs增加了MC3T3-E1成骨標(biāo)志物mRNA的表達(dá)
　　為了進(jìn)一步確定PDLSCs對(duì)MC3T3-E1成骨分化的作用，RT-PCR檢測共培養(yǎng)不同時(shí)間段后，PDLSCs與MC3T3-E1共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組和僅有MC3T3-E1的培養(yǎng)對(duì)照組中基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在與PDLSCs共培養(yǎng)了7天后，MC3T3-E1的ALP和BSP基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，但是OPN的基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。在第14和21天時(shí)，A

12、LP、BSP、OPN的基因表達(dá)水平均顯著升高，并且在共培養(yǎng)體系中，ALP基因表達(dá)水平在第14天時(shí)最高，BSP和OPN的基因表達(dá)水平在第21天時(shí)最高。
　　2.3 PDLSCs促進(jìn)MC3T3-E1的BSP和OPN的蛋白表達(dá)
　　Western blotting檢測共培養(yǎng)不同時(shí)間段后，PDLSCs與MC3T3-E1共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組和僅有MC3T3-E1的培養(yǎng)對(duì)照組中成骨標(biāo)志性蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組與對(duì)照組相比，BSP蛋白表達(dá)

13、在第7、14、21天時(shí)均顯著增加，晚期成骨標(biāo)志性蛋白OPN在第14和21天時(shí)亦顯著增加。
　　2.4 PDLSCs增加了MC3T3-E1礦物沉積
　　在第21天時(shí)，與對(duì)照組相比，PDLSCs顯著增強(qiáng)了MC3T3-E1的礦物化;通過菌素紅染色可以看到共培養(yǎng)體系中礦化結(jié)節(jié)有所增大。
　　3.牙周膜干細(xì)胞對(duì)破骨前體細(xì)胞破骨分化作用研究
　　3.1 PDLSCs促進(jìn)了RAW264.7破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成
　　應(yīng)用T

14、RAP染色來檢測與PDLSCs共培養(yǎng)的RAW264.7破骨細(xì)胞分化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PDLSCs顯著增加了RANKL刺激下RAW264.7 TRAP+的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成。
　　3.2 PDLSCs增強(qiáng)了RAW264.7破骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)
　　通過檢測與PDLSCs共培養(yǎng)的RAW264.7實(shí)驗(yàn)組和僅有RAW264.7培養(yǎng)的對(duì)照組破骨標(biāo)志基因的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證PDLSCs對(duì)破骨分化過程的影響。結(jié)果顯示，在與PDL

15、SCs共培養(yǎng)的RAW264.7實(shí)驗(yàn)組中，TRAP、TRAF6和CTSK的表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　3.3 PDLSCs增加了RAW264.7 TRAP和TRAF6的蛋白表達(dá)水平
　　Western blotting檢測與PDLSCs共培養(yǎng)的RAW264.7實(shí)驗(yàn)組和僅有RAW264.7培養(yǎng)的對(duì)照組破骨標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在第3天和第7天時(shí)，共培養(yǎng)體系中RAW264.7的TRAP和TRAF6的蛋白表達(dá)顯著增加。

16、
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)通過間接共培養(yǎng)體系研究顯示，PDLSCs能夠增強(qiáng)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1 ALP活性，增加ALP、BSP、OPN mRNA和BSP、OPN蛋白的表達(dá)以及礦化基質(zhì)的沉積。同時(shí)能促進(jìn)了破骨細(xì)胞的成熟，提高了破骨前體細(xì)胞RAW264.7TRAP、CSTK、TRAF6 mRNA和TRAP、TRAF6蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PDLSCs可能以旁分泌的形式在一定程度上調(diào)節(jié)成骨分化和破骨分化。同時(shí)反映了PDL