降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞破骨分化和骨吸收功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在臨床上我們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷（如截癱或者顱腦損傷）的患者若同時(shí)伴有四肢長(zhǎng)骨骨折時(shí)，常常在骨折區(qū)出現(xiàn)大量骨痂的過(guò)度生長(zhǎng)，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)異位骨化，其骨折愈合的速度也快于不伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的四肢長(zhǎng)骨骨折患者；相反的若是骨折患者同時(shí)伴有明顯周圍神經(jīng)損傷時(shí)，骨折愈合的過(guò)程將出現(xiàn)明顯的延長(zhǎng)，延遲愈合甚至是骨不愈合的可能增高。大量文獻(xiàn)表明中樞神經(jīng)受到損傷后，神經(jīng)肽類物質(zhì)在外周血液中的濃度升高，這可能是導(dǎo)致骨痂過(guò)度生長(zhǎng)的重要原因；這些神經(jīng)肽類物質(zhì)

2、其中就包括降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和P物質(zhì)等。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種體內(nèi)廣泛分布的神經(jīng)肽，研究發(fā)現(xiàn)其具有促成骨的作用，但是CGRP對(duì)骨吸收中破骨前體細(xì)胞即骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMMs)的是否具有調(diào)控作用尚不清楚。因此我們課題組設(shè)計(jì)了相應(yīng)實(shí)驗(yàn)，來(lái)探究CGRP對(duì)SD大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMMs)破骨分化和骨吸收功能的影響，闡明其影響骨代謝的分子機(jī)制，為骨修復(fù)和骨重建提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)一降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠骨髓源

3、性巨噬細(xì)胞破骨分化的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞破骨分化的影響。
　　方法：（1）采用差速貼壁的方法分離出SD大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞，原代培養(yǎng)并傳代，而后加入適當(dāng)濃度的sRANKL和M-CSF，進(jìn)行大鼠破骨前體細(xì)胞的破骨分化誘導(dǎo)。（2）實(shí)驗(yàn)分組：A:空白對(duì)照組（不含CGRP）；B：高劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-7mol/L）；C：中劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-8mol/L）

4、；D：低劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-9mol/L）。（3）加入不同濃度CGRP后破骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶染色法（TRAP染色）觀察破骨細(xì)胞形態(tài)并對(duì)成熟的破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。(4)加入不同濃度CGRP后破骨分化誘導(dǎo)7天，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)破骨分化特異性特基因（RANK、TRAP、NFATc1）mRNA的表達(dá)。（5）對(duì)加入不同濃度CGRP破骨分化誘導(dǎo)7天后的破骨細(xì)胞進(jìn)行處理，通過(guò)Western-blo

5、t檢測(cè)破骨特征性TRAP和RANK蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）TRAP染色顯示，相對(duì)于空白對(duì)照組不同濃度CGPR處理組的成熟破骨細(xì)胞數(shù)目顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）并且隨CGRP濃度的增高成熟破骨細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），組間亦有明顯差異（P<0.05）。（2） RT-PCR檢測(cè)破骨分化特異性特基因RANK、TRAP、NFATc1 mRNA和Western-blot測(cè)破骨特征性TRAP、RANK蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示不

6、同濃度CGRP組均明顯低于空白對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外骨髓源性巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法，觀察到CGRP具有抑制破骨前體細(xì)胞破骨分化的作用，提示CGRP在骨修復(fù)及骨重建中可能發(fā)揮重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)二降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞破骨誘導(dǎo)后骨吸收功能的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞破骨誘導(dǎo)后骨吸收功能的影響。
　　方法：（1）采用

7、差速貼壁的方法分離出SD大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞，原代培養(yǎng)并傳代，而后加入適當(dāng)濃度的sRANKL和M-CSF，進(jìn)行大鼠破骨前體細(xì)胞的破骨分化誘導(dǎo)。（2）實(shí)驗(yàn)分組：A:空白對(duì)照組（不含CGRP）;B：高劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-7mol/L）；C：中劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-8mol/L）；D：低劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-9mol/L）。（3）用不含CGRP的破骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)骨髓源性巨噬細(xì)胞7天后，采用

8、抗酒石酸酸性磷酸酶染色法（TRAP染色）觀察破骨細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行鑒別。（4）在不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)WST-1法檢測(cè)不同濃度CGRP對(duì)大鼠破骨前體細(xì)胞BMMs增殖率的影響。（5）加入不同濃度CGRP后將破骨前體細(xì)胞BMMs破骨分化誘導(dǎo)7天，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞骨吸收功能性基因MMP-9、Cathepsin K mRNA的表達(dá)。（6）將BMMs接種于骨磨片上，用含有不同濃度CGRP的破骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7天后，對(duì)骨磨片行甲苯胺藍(lán)染色

9、檢測(cè)CGRP對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收功能的影響。
　　結(jié)果：（1）與空白對(duì)照組相比，各CGRP處理組對(duì)破骨前體細(xì)胞BMMs的增殖具有抑制作用，且隨著CGRP濃度的升高，抑制作用更加明顯。（2）RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CGRP處理組明顯抑制破骨相關(guān)酶MMP-9和Cathepsin K mRNA的表達(dá)。（3）甲苯胺藍(lán)骨磨片染色顯示，與空白對(duì)照組相比，CGRP處理組的骨陷窩數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且CGR