降鈣素基因相關肽通過NLRP3途徑抑制小鼠巨噬細胞系炎性激活實驗研究.pdf

1、目的：
　　降鈣素基因相關肽(calcitonin-gene-related peptide，CGRP)是一種具有許多不同功能由神經(jīng)分泌的多肽，許多實驗研究表明，異常巨噬細胞活化和產(chǎn)生自身核酸的自身抗體是特征系統(tǒng)性紅斑狼瘡。有人建議雌激素可以自身反應性B細胞的增殖和刺激驅(qū)動M2巨噬細胞[1，2]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)在干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)，一個主要的非—SLE的HLA風險等位基因，已被證明有男性高頻率[3]。IRF5最

2、近為提高M1巨噬細胞分化[因此，它是可能的巨噬細胞差異男性和女性SLE患者的調(diào)節(jié)。炎癥的多蛋白復合物含有核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)類似物在黑色素瘤細胞或缺乏2（目標），從而激活Caspase-1在刺激和促進IL-1β生產(chǎn)NOD樣受體失調(diào)(NLR)PYRIN含蛋白3（NLRP3炎性體具有域）
　　神經(jīng)肽P物質(zhì)降鈣素基因相關肽分別包含11和37種氨基酸。它們經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)于感覺神經(jīng)元，它們分泌量的增加通常來源于共同的刺激物。有各種研究

3、表明神經(jīng)肽可誘導巨噬細胞促炎性細胞因子的生產(chǎn)。降鈣素基因相關肽可改善因缺氧導致的心肌細胞炎癥和改善一氧化氮介導的心肌細胞凋亡。將H9c2心肌細胞暴露于缺氧的環(huán)境中2小時，以建立缺氧缺血的環(huán)境，炎性小體是一種高分子量的蛋白復合體。它形成于當細胞受到危險或被相關病原體侵襲時的胞漿中。
　　研究中，我們使用不同濃度CGRP刺激靜息狀態(tài)下和LPS活化狀態(tài)下的小鼠RAW264.7巨噬細胞，探討CGRP對巨噬細胞炎性因子IL-1β，TNF-α

4、分泌的影響及機制。
　　方法：
　　1.在體外培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7，讓其生長于DMEM培養(yǎng)基（含10％FBS，1×105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素）中，37℃，5％CO2條件下中培養(yǎng)，3-4d傳代一次，傳代比例為1∶3。
　　2.在小鼠巨噬細胞中加入含有不同濃度CGRP和/或LPS的DMEM培養(yǎng)液(LPS50ng/mL,CGRP10ng/mL,CGPR30ng/mL,CGRP100ng/mL,CGRP3

5、0ng/mL+LPS50ng/mL)預處理。
　　3.使用qRT-PCR擴增儀檢測CGRP和/或LPS處理后的小鼠巨噬細胞IL-1β，TNF-α和NLRP3mRNA表達水平
　　4.采用小IL-1β腫瘤壞死因子，定量分析酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒對CGRP和/或LPS處理后的小鼠巨噬細胞進行檢測。
　　5.蛋白免疫印跡法檢測不同濃度CGRP和/或LPS處理小鼠RAW264.7細胞后，NLRP3，Caspase-1和Proc

6、aspase-1的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.細胞培養(yǎng)：經(jīng)鏡下觀察巨噬細胞成圓形或/和橢圓形，貼壁生長，狀態(tài)良好。
　　2.在體外小鼠巨噬細胞培養(yǎng)基中CGRP和/或LPS2，小鼠巨噬細胞在含不同濃度(LPS50ng/mL,CGRP10ng/mL,CGPR30ng/mL,CGRP100ng/mL,CGRP30ng/mL+LPS50ng/mL)培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)，3天后順利提取RNA、蛋白，預備下步實驗。
　

7、　3.qRT-PCR檢測小鼠IL-1β、TNF-α、NLRP3mRNA,果提示CGRP處理LPS活化和未活化巨噬細胞后，IL-1β、TNF-αmRNA分泌水平較空白對照組相比，均明顯降低(P＜0.05)，且成濃度依賴性。
　　4.小鼠的IL-1β、TNF-αELISA試劑盒結(jié)果提示：CGRP(10ng/mL、30ng/mL，100ng/mL)處理后，IL-1β、TNF-αmRNA分泌水平與空白對照組相比，明顯降低(P＜0.05)，

8、且成濃度依賴性。
　　5.蛋白免疫印跡法檢測不同濃度CGRP和/或LPS處理小鼠RAW264.7細胞后，NLRP3，Caspase-1蛋白表達水平和mRNA一致，Procaspase-1蛋白表達較對照組無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.本研究表明，CGRP抑制巨噬細胞炎性激活，其機制可能與CGRP抑制NLRP3表達與活性有關;
　　2.LPS可刺激巨噬細胞，炎性因子分泌增加;
　　3.CGRP能抑制巨噬細胞