HBV通過激活NLRP3炎性體促進Il-1β產(chǎn)生的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)簡稱乙肝病毒，是一種小環(huán)型部分雙鏈DNA病毒，其基因組至少包含S（包含S基因、PreS1基因和PreS2基因）、C、X、P等4個開放讀碼框架，分別編碼包膜抗原(HBs)、核心蛋白(HBc)、X蛋白(HBx)和DNA聚合酶。HBV屬于嗜肝病毒屬，但沒有直接的肝細(xì)胞毒性，病毒感染后引發(fā)的免疫性肝損傷是其致病的重要機制，HBV感染后可進一步導(dǎo)致肝硬化或肝細(xì)胞肝癌的

2、發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界HBV感染人數(shù)已超過4億，每年約100余萬人死于HBV相關(guān)肝病，因HBV相關(guān)疾病死亡的人數(shù)占全球40％左右，因此，HBV是目前危害人類健康的主要殺手之一，但HBV感染致免疫性肝損傷的作用尚不十分清楚，其致病機制亟待于深入探討。
　　 長期以來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HBV的成功清除與體內(nèi)較強的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)，然而，越來越多的證據(jù)表明固有免疫在HBV感染及致病過程中發(fā)揮重要作用，明確HBV感染引發(fā)的免疫效應(yīng)及

3、分子機制對于HBV相關(guān)肝病的診斷和治療極為關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后是由肝臟非實質(zhì)細(xì)胞識別，主要由枯否氏細(xì)胞（Kupffercell，KC）識別。KC是肝臟中定居的巨噬細(xì)胞，占全身巨噬細(xì)胞總數(shù)的80％-90％，是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，也是肝內(nèi)主要的炎性反應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子來源，KC通過產(chǎn)生IL-1β、IL-18等炎癥因子參與各種慢性肝病過程中肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。
　　 IL-1β和IL-18的產(chǎn)生依賴于炎性體的激活。炎性體（也稱

4、炎癥小體）是Tschopp等于2002年首次發(fā)現(xiàn)并報道的，第一個被發(fā)現(xiàn)的炎性體是NLRP1炎性體。隨著研究的深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的炎性體有NLRP3（或NALP3）、NLRC4、AIM2、RIG-Ⅰ炎性體等，其中，NLRP3炎性體被研究得最多，NLRP3分子通過接頭蛋白ASC招募Caspase-1，從而組成多蛋白復(fù)合物即NLRP3炎性體。多種病毒感染可介導(dǎo)NLPR3炎性體的活化，NLRP3炎性體即可感應(yīng)RNA病毒如流感病毒、丙型肝炎病毒(HC

5、V)，也可感應(yīng)DNA病毒如腺病毒、水痘-帶狀皰疹病毒，由此說明無包膜的小分子DNA病毒或有包膜的大分子DNA病毒都可調(diào)節(jié)NLRP3炎性體的活化。炎性體的激活可使Caspase-1活化進而對IL-1β或IL-18前體進行剪切，促進IL-1β或IL-18的成熟和釋放，引起炎癥反應(yīng)。
　　 文獻報道，IL-18、IL-1β啟動子基因多態(tài)性與HBV感染后的疾病進程及預(yù)后密切相關(guān)，HBx蛋白和HBc蛋白可誘導(dǎo)IL-18的產(chǎn)生，慢乙肝患者血

6、清中IL-1β的水平顯著高于正常人，且乙肝患者體內(nèi)IL-1β的水平與HBV病毒滴度呈正相關(guān)。那么HBV如何調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的產(chǎn)生呢？目前尚未見相關(guān)研究的報道，本文首次探討了HBV對NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)作用。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白樣蛋白(T-cellimmunoglobulindomainandmucindomain，Tim)家族是McIntire于2001年發(fā)現(xiàn)并鑒定的與哮喘和過敏性疾病相關(guān)的一個新基因家族

7、。小鼠Tim基因家族位于染色體1181.1，目前共發(fā)現(xiàn)8個基因，編碼蛋白Tim-1-Tim-4和4個假想基因Tim-5-Tim-8。人類TIM家族只有3個基因，定位于染色體5q33.2，分別編碼蛋白TIM-1、TIM-3、TIM-4。Tim蛋白是一類具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括免疫球蛋白(IgV)樣區(qū)、黏蛋白(Mucin)樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。除Tim-4外，Tim-1、Tim-2、Tim-3胞內(nèi)區(qū)均含有酪氨酸激酶磷酸化位點

8、，直接參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 Tim-4分子在免疫調(diào)節(jié)及維持機體穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。Tim-4是Tim-1的天然配體，主要表達在活化的抗原提呈細(xì)胞表面，能維持腹腔巨噬細(xì)胞平衡，Tim-4與Tim-1相互作用可為T細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號，Tim-4對T細(xì)胞的活化具有雙重調(diào)控作用，而Tim-4對巨噬細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tim-4過表達可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸Tim

9、-4過表達的巨噬細(xì)胞系可抑制IL-1β的產(chǎn)生，提示Tim-4可能抑制炎性體的活化。另外，發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者PBMCs、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝單個核細(xì)胞中Tim-4的表達水平顯著減低，那么HBV如何調(diào)節(jié)Tim-4的表達，是否通過調(diào)節(jié)其啟動子活性進而影響其表達呢？HBV是否通過調(diào)節(jié)Tim-4的表達影響NLRP3炎性體的活性呢？本文基于相關(guān)問題進行了初步探討。
　　 研究目的：
　　 明確HBV對NLRP3炎性體活性的影響，并初步探討

10、其作用機制;構(gòu)建人TIM-4啟動子報告基因載體并鑒定其活性;探討TIM-4對NLRP3炎性體活性的影響。
　　 方法：
　　 第一部分:HBV對NLRP3炎性體活化的影響
　　 1.臨床標(biāo)本檢測
　　 (1)收集慢乙肝患者及健康對照血漿標(biāo)本
　　 收集了56例慢乙肝患者的初診病人和20例健康對照組的肝素抗凝血，離心取上清，-20℃保存。
　　 (2)ELISA檢測血漿中IL-1β的水平

11、r>　　 利用ELISA試劑盒檢測初診的慢乙肝病人以及健康對照組的血漿中IL-1β的水平。
　　 2.動物實驗
　　 (1)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對照
　　 取鑒定為陽性的8-12周齡的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Balb/c)35只，以及由山東大學(xué)動物中心提供的12只同齡Balb/c小鼠為正常對照。
　　 (2)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清DNA及抗原的檢測
　　 分批處死HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，摘眼球取血，室溫放置

12、2h，4℃離心收取上清，檢測HBVDNA及表面抗原。
　　 (3)ELISA檢測血清中IL-1β的水平
　　 用ELISA試劑盒檢測HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與健康對照鼠血清中的IL-1β。
　　 (4)Westernblot檢測小鼠肝組織中Caspase-1的活化
　　 隨機選取14例HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對照小鼠的肝組織，取米粒大小的肝組織，勻漿并提取蛋白，Westernblot檢測Caspase-1的活化情況

13、。
　　 3.細(xì)胞模型
　　 (1)Caspase-1、ASC、NLRP3siRNA的篩選與鑒定
　　 分別設(shè)計并合成了人ASC、caspase-1、NLRP3三個基因的小干擾套餐，在HEK293細(xì)胞中用質(zhì)粒DNA與小干擾用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)染48h后，收取細(xì)胞，提蛋白，用Westernblot驗證干擾效果，選取效果較好的進行后續(xù)實驗。同時，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，驗證以上基因siRNA對內(nèi)源性基

14、因的干擾效果。
　　 (2)HepG2.2.15或HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激THP-1細(xì)胞
　　 常規(guī)培養(yǎng)HepG2或HepG2.215細(xì)胞（無G418），待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶即將傳代時，收取其上清，1.5mlEp管分裝并凍存于-80℃，避免反復(fù)凍融。
　　 THP-1細(xì)胞以4-5×105/ml的密度接種于24孔板，分別加入200μl的HepG2或HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激0h、3h、24h或48h，加上清前

15、吸取出等量的培養(yǎng)基，以保持相同的培養(yǎng)體系。輕輕晃動細(xì)胞板混勻，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育24h，離心收取上清及細(xì)胞。
　　 (3)HepG2.2.15或HepG2細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)
　　 利用corningtranswell小室，THP-1細(xì)胞以4×105/ml的密度接種于12孔板下室，HepG2.2.15/HepG2細(xì)胞鋪于上室。THP-1細(xì)胞數(shù)目固定，設(shè)THP-1/HepG2或HepG2.215細(xì)胞分別

16、為1∶1、1∶2和1∶4三個比例，共培養(yǎng)48h后收細(xì)胞及上清。
　　 (4)ELISA檢測IL-1β的水平
　　 同上檢測上清中IL-1β的水平。
　　 (5)細(xì)胞免疫熒光觀察HBV促NLRP3炎性體的形成
　　 HepG2或HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激48h后，收集細(xì)胞，以4％多聚甲醛固定，以兔抗人Caspase-1、NLRP3單克隆抗體為一抗、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進行免疫熒光染色，熒光

17、顯微鏡觀察紅色熒光，拍照保存。
　　 4.NLRP3炎性體重構(gòu)實驗
　　 (1)NLRP3炎性體重構(gòu)體系的建立
　　 參考文獻建立NLRP3炎性體重構(gòu)系統(tǒng)，將HEK293細(xì)胞、HepG2、HeLa、Huh7細(xì)胞分別接種于24孔培養(yǎng)板，利用Lipofectin2000共轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒及其用量分別為:pDsRed-monomer-C1-humanASC5ng、pDsRed-monomer-C1-humanc

18、aspase-15ng、pCR4-TOPO-humanNLRP315ng、pDsRed-monomer-C1-humanIL-1beta150ng，混勻后共轉(zhuǎn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染5-6h換成含血清的培養(yǎng)基。48h后收取細(xì)胞及其上清，ELISA檢測上清中IL-1β，提取蛋白Westemblot檢測Caspase-1的活化情況。
　　 (2)HBV質(zhì)粒DNA與NLRP3炎性體共轉(zhuǎn)
　　 在HEK2

19、93、HepG2、HeLa、Huh7細(xì)胞中分別進行共轉(zhuǎn)染，NLRP3炎性體組分質(zhì)粒DNA用量同上，分別同時轉(zhuǎn)入pcDNA3.0或pcDNA3.0-HBV1.1質(zhì)粒DNA600ng，轉(zhuǎn)染48h后收取細(xì)胞及其上清。
　　 (3)ELISA檢測IL-1β的水平
　　 收取細(xì)胞上清，用eBioscience公司的humanIL-1βELISA試劑盒檢測IL-1β。
　　 (4)Westernblot檢測Caspase-1

20、的活化
　　 24孔板轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，收細(xì)胞，提取蛋白，Westernblot檢測Caspase-1的活化情況。
　　 (5)ASC表達載體的構(gòu)建及過表達穩(wěn)篩細(xì)胞系的建立
　　 a.構(gòu)建真核載體pc3-hASC-HA，以pDsRed-monomer-C1-hASC載體為模板，以加了HA標(biāo)簽的下游引物來擴增hASC-HA基因片段，雙酶切后連入pcDNA3.0載體。經(jīng)測序并比對無誤后的的重組載體經(jīng)WesternBl

21、ot驗證。
　　 b.HEK293細(xì)胞最佳G418的篩選濃度:將HEK293細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/ml，分別加入G418，使其終濃度為400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml，隔1-2天換含相同G418濃度的培養(yǎng)基，兩至三周后觀察結(jié)果，HEK293細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度即為最佳篩選濃度。
　　 建立ASC過表達穩(wěn)篩細(xì)胞系:HEK293細(xì)胞鋪板后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pDsRed-mon

22、omer-C1-humanASC，轉(zhuǎn)染48h后換成含800μg/mlG418的培養(yǎng)基，隔1-2天換液。穩(wěn)篩兩周后，熒光顯微鏡觀察，提取蛋白Westernblot檢測ASC的表達。
　　 (6)共培養(yǎng)體系驗證HBV可能通過Rac1激活NLRP3炎性體
　　 THP-1細(xì)胞以4×105/ml的密度種板，用320nMPMA(12-16h)誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后，Rac1小干擾干擾24h后，再與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)48h后E

23、LISA檢測培養(yǎng)上清中的IL-1β水平。
　　 第二部分:人TIM-4啟動子報告基因載體的構(gòu)建及檢測
　　 (1)人TIM-4啟動子系列載體的構(gòu)建
　　 利用軟件預(yù)測并分析了人TIM-4基因的啟動子-1887/+65，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點設(shè)計系列截短的啟動子。
　　 以健康人外周血PBMC基因組DNA為模板，利用高保真酶PCR擴增出人TIM-4基因啟動子區(qū)域-1887至+65（轉(zhuǎn)錄起始位點為+1）片段，

24、膠回收PCR產(chǎn)物連T載體，藍白斑篩選等鑒定陽性克隆，經(jīng)SacⅠ、XhoⅠ雙酶切連入經(jīng)相同酶切的pGL3載體，轉(zhuǎn)化、涂板、雙酶切、測序鑒定陽性克隆。
　　 以載體pGL3-humanPTIM4(-1887/+65)為模板，構(gòu)建-1682/+65、-1307/+65、-1162/+65、-887/+65、-662/+65、-392/+65、-162/+65、-42/+65等截短的啟動子。
　　 (2)啟動子活性檢測
　

25、　 雙熒光素酶法檢測分析報告質(zhì)粒人TIM-4啟動子的活性。A549細(xì)胞以2×105個/ml的密度鋪于48孔板，以啟動子質(zhì)粒DNA500ng/孔、pGL-TK10ng/孔利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，吸掉培養(yǎng)基，PBS洗三遍，以1×PBL細(xì)胞裂解液徹底裂解細(xì)胞，用熒光計數(shù)儀檢測啟動子的熒光素酶活性與內(nèi)參pGL-TKRenilla熒光素酶活性，比較其ratio值。每次實驗設(shè)3復(fù)孔，取平均值。
　　 第三部分:TIM-4對NL

26、RP3炎性體活性的影響
　　 (1)NLRP3炎性體重構(gòu)
　　 同上重構(gòu)NLRP3炎性體，利用脂質(zhì)體法分別同時轉(zhuǎn)入pcDNA3.0或pcDNA3.0-TIM-4600ng，轉(zhuǎn)染48h后收細(xì)胞及其上清，檢測IL-1β的水平。
　　 (2)小鼠TIM-4系列表達載體的構(gòu)建與鑒定
　　 構(gòu)建小鼠TIM-4全長及不同結(jié)構(gòu)域缺失的系列載體:pEGFP-Mtim-4(fulllength)、pEGFP-mTIM-4(

27、△C)（胞內(nèi)區(qū)缺失）、pEGFP-mTIM-4(△TC)（跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)缺失）、pEGFP-mTIM-4(△TC)-DAF（跨膜區(qū)以人DAF跨膜區(qū)代替），分別以PCR、酶切、測序鑒定序列的正確性。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:HBV對NLRP3炎性體活化的影響
　　 1.HBV感染導(dǎo)致IL-1β升高
　　 慢乙肝患者（初診）及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中IL-1β

28、水平顯著高于正常對照(p＜0.05)，但并未發(fā)現(xiàn)其與HBVDNA及抗原的相關(guān)性。
　　 2.HBV促單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β
　　 共培養(yǎng)實驗結(jié)果表明隨著HepG2.2.15細(xì)胞數(shù)目的減少，IL-1β的產(chǎn)生也隨之降低。
　　 HepG2細(xì)胞或HepG2.2.15上清處理THP-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含HBV上清呈時間依賴性刺激IL-1β的產(chǎn)生，HepG2.2.15細(xì)胞上清也可顯著刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-1

29、β。
　　 3.HBV促單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β依賴于Caspase-1
　　 THP-1細(xì)胞用Caspase-1抑制劑處理1-1.5h后，進行HepG2.2.15上清處理48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-1抑制劑處理組IL-1β水平顯著低于DMSO對照組。
　　 4.HBV促IL-1β產(chǎn)生是通過NLRP3炎性體發(fā)揮作用
　　 4.1.驗證小干擾效果
　　 利用質(zhì)粒DNA或siRNA共轉(zhuǎn)染HEK

30、293細(xì)胞、siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，Westernblot檢測驗證Caspase-1、ASC、NLRP3siRNA的干擾效果，結(jié)果顯示siNLRP3-978、2545可顯著抑制NLRP3蛋白的表達;siASC-217、397、499均具有干擾效果;siCaspase-1-788、1094干擾效果較好。
　　 4.2.NLRP3在HBV誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用
　　 THP-1細(xì)胞(5×105/ml)接種于

31、12孔培養(yǎng)板，以終濃度為320nmol/ml的PMA誘導(dǎo)12-16h貼壁，轉(zhuǎn)染前換成無血清的培養(yǎng)基，用Lipo2000轉(zhuǎn)siNLRP3-9785μl/孔，6-8h換成含10％血清的培養(yǎng)基，干擾24h后，加入HepG2.2.15細(xì)胞與之共培養(yǎng)48h收細(xì)胞及其上清，結(jié)果表明:與對照組相比，干擾NLRP3后HBV誘導(dǎo)的IL-1β水平顯著降低。
　　 5.HBV促進NLRP3炎癥小體組裝
　　 5.1.NLRP3炎性體重構(gòu):參考

32、相關(guān)文獻，利用HEK293/HepG2/Hela/Huh7細(xì)胞重構(gòu)NLRP3炎癥小體。實驗結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染pcDNA3-HBV1.1可顯著促進IL-1β的產(chǎn)生，與對照組相比，Westernblot檢測結(jié)果顯示HBV可促進Caspase-1的活化。
　　 5.2.HBV促進NLRP3炎性體的形成:含HBV上清刺激THP-1細(xì)胞48h，免疫熒光檢測NLRP3、Caspase-1分子的表達，利用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示HBV刺激組表達

33、水平上調(diào)。
　　 5.3.ASC過表達穩(wěn)篩細(xì)胞系的建立:利用HEK293細(xì)胞確定G418的有效作用濃度為800μg/ml，pDsRed-express-C1-ASC及空載體pDsRed-express-C1分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并利用含800μg/mlG418培養(yǎng)基進行篩選，待細(xì)胞克隆形成后進行傳代，利用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)篩選的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，Westernblot可檢測到ASC蛋白的表達。
　　 5.4.真核表達

34、載體pcDNA3.0-humanASC-HA的構(gòu)建:陽性克隆分別利用PCR及酶切、測序鑒定，PCR可擴增ASC特異性片段，經(jīng)HindⅢ、XbaⅠ酶切鑒定，測序結(jié)果經(jīng)blast分析序列與genebank提供的人ASC基因序列完全一致。pcDNA3.0-humanASC-HA質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，利用HA抗體可檢測到其蛋白的表達。
　　 6.HBV通過Rac1激活NLRP3炎性體
　　 THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)

35、貼壁，轉(zhuǎn)染RaclsiRNA及對照24h，再用含HBV的HepG2.2.15細(xì)胞與之共培養(yǎng)48h，ELISA檢測結(jié)果顯示Rac1干擾組IL-1β水平低于對照組。
　　 第二部分:人TIM-4啟動子報告基因載體的構(gòu)建及檢測
　　 成功構(gòu)建人TIM-4啟動子報告基因的全長及系列截短載體，啟動子活性待驗證。
　　 第三部分:TIM-4對NLRP3炎性體活性的影響
　　 NLRP3炎性體重構(gòu)體系中，過表達TIM-

36、4可顯著抑制IL-1β的產(chǎn)生。
　　 成功構(gòu)建了小鼠TIM-4的不同功能域缺失的載體pEGFP-mTIM4(fulllength)、pEGFP-mTIM4(△C)、pEGFP-mTIM4(△TC)、pEGFP-mTIM4(△TC)-DAF，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，于熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用慢乙肝病人及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠證實HBV可促進IL-1β的產(chǎn)生，提示其產(chǎn)生與炎性體激活有關(guān)。

37、>　　 2.利用THP-1細(xì)胞證實HBV誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生依賴于Caspase-1。
　　 3.利用THP-1細(xì)胞及重構(gòu)實驗證實HBV通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生。
　　 4.HBV通過Rac1通路激活NLRP3炎性體。
　　 5.TIM-4抑制NLRP3炎性體的活化。
　　 創(chuàng)新點及意義：
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)HBV通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)Caspase-1的活化及IL-