Tim-3對(duì)NLRP3炎性小體的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：近年來(lái)，多種自身免疫性疾病及炎癥性疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、Ⅰ型糖尿病、胰腺炎、腹膜炎等發(fā)病率逐年升高，對(duì)人們生命健康造成了極大的威脅。研究表明，在多種自身免疫性疾病以及炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程中存在NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor, pyrin domain-containing3，NLRP3）炎癥小體的過(guò)度活化引起的炎癥因子白細(xì)胞介素-1beta（inteleukine-1beta，IL-1β）大量釋放，進(jìn)

2、而引起劇烈的炎癥反應(yīng)。所以，探索機(jī)體中NLRP3炎癥小體的調(diào)控機(jī)制及尋找其負(fù)性調(diào)控分子成為了科研工作者迫切要解決的課題。目前研究認(rèn)為，NLRP3炎癥小體的活化需要兩個(gè)信號(hào)：預(yù)激信號(hào)（第一信號(hào)）和激活信號(hào)（第二信號(hào)），其中第一信號(hào)主要負(fù)責(zé)NLRP3炎性小體復(fù)合體組分和效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，第二信號(hào)則是將NLRP3炎性小體各組分由各自獨(dú)立狀態(tài)組合成復(fù)合體，同時(shí)激活NLRP3炎性小體，處于活化狀態(tài)的NLRP3炎性小體可以促進(jìn)炎癥因子IL-1β、

3、IL-18的成熟與釋放，從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)和特定條件下疾病的發(fā)生。T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白-3（T-cell Ig-mucin-3，Tim-3）是一新的具有抑制活性的免疫檢查點(diǎn)分子。Tim-3在T細(xì)胞上的異常表達(dá)與多種免疫相關(guān)性疾病如腫瘤、病毒感染等相關(guān)，因此被認(rèn)為是新一代的免疫調(diào)控靶點(diǎn)。近年來(lái)，Tim-3在天然免疫細(xì)胞上的表達(dá)及功能越來(lái)越受到人們的重視，然而Tim-3調(diào)控天然免疫的機(jī)制尚不十分清楚。作為天然免疫效應(yīng)成分的炎癥小體是

4、否也受到Tim-3調(diào)控是非常值得探討的課題。我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)Tim-3能夠通過(guò)抑制TLR4參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。鑒于TLR4在NLRP3炎性小體的活化過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用，那么 Tim-3分子是否也參與調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化？其參與調(diào)控的機(jī)制是什么？這將是本課題研究的主要內(nèi)容。
　　目的：探討Tim-3對(duì)NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　方法：⑴Tim-3對(duì)NLRP3炎性小體活化作用的探討。從Tim

5、-3高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠（Tim-3-TG）和野生型小鼠(WT)中分離出腹腔巨噬細(xì)胞，使用NLRP3炎性小體活化的第一信號(hào)激活劑LPS和第二信號(hào)激活劑ATP進(jìn)行刺激，觀(guān)察巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性小體的活化情況。使用Tim-3融合蛋白（Tim-3-Ig）阻斷鼠源巨噬細(xì)胞系RAW264.7中Tim-3信號(hào)通路，觀(guān)察NLRP3炎性小體的活化情況；⑵Tim-3調(diào)控NLRP3炎性小體的機(jī)制探討：對(duì)復(fù)合物成分轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響。使用Tim-3-Ig阻斷

6、Tim-3信號(hào)通路，觀(guān)察鼠源巨噬細(xì)胞系RAW264.7以及J774A.1在NF-κB抑制劑存在和不存在的條件下NLRP3及IL-1β在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。使用LPS刺激Tim-3-TG和WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀(guān)察NLRP3和IL-1β在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況；⑶Tim-3調(diào)控NLRP3炎性小體的機(jī)制探討：對(duì)復(fù)合物成分組裝及活性的影響。使用Tim-3-Ig阻斷Tim-3信號(hào)通路，觀(guān)察RAW264.7細(xì)胞中ATP釋放、K+外

7、流和ROS的產(chǎn)生情況，并觀(guān)察在K+外流和ROS的產(chǎn)生受到抑制的情況下NLRP3炎性小體的活化情況；⑷Tim-3調(diào)控NLRP3炎性小體的分子機(jī)制探討。構(gòu)建Tim-3分子256/263位點(diǎn)酪氨酸雙突變體，觀(guān)察這兩個(gè)位點(diǎn)突變后Tim-3對(duì)NLRP3炎性小體的表達(dá)和活化的影響情況；⑸Tim-3與腹膜炎患者中NLRP3炎性小體表達(dá)的關(guān)系研究。收集并檢測(cè)臨床腹膜炎患者血清中可溶性Tim-3蛋白的表達(dá)情況，并觀(guān)察人源巨噬細(xì)胞系THP-1和U937在T

8、im-3信號(hào)通路阻斷的情況下NLRP3和IL-1βmRNA的表達(dá)情況；⑹Tim-3信號(hào)對(duì)小鼠腹膜炎進(jìn)程的影響。構(gòu)建小鼠腹膜炎模型，觀(guān)察在Tim-3高表達(dá)和阻斷Tim-3信號(hào)通路后小鼠腹膜炎的炎癥反應(yīng)程度以及體內(nèi)NLRP3炎癥小體活化情況。
　　結(jié)果：①和WT組相比，Tim-3-TG組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中LPS和ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體的活化受到了抑制，表現(xiàn)為caspase-1活性的抑制以及IL-1?分泌的顯著降低。而用Tim-

9、3-Ig阻斷Tim-3信號(hào)通路后，NLRP3炎性小體的活性被激活；②Tim-3-Ig阻斷Tim-3信號(hào)通路后，NF-κB活性增加，NLRP3和IL-1β在mRNA和蛋白水平表達(dá)升高，當(dāng)NF-κB受到抑制后，NLRP3和IL-1β表達(dá)也受到了抑制；③Tim-3-Ig阻斷Tim-3通路后，ATP的釋放、K+外流和ROS的產(chǎn)生增加，IL-1β釋放增強(qiáng)，當(dāng)K+外流和ROS的產(chǎn)生受到抑制后，IL-1β釋放也受到了抑制；④當(dāng)Tim-3分子256/2

10、63酪氨酸位點(diǎn)雙突變后，Tim-3對(duì)NLRP3炎性小體抑制作用減弱；⑤臨床腹膜炎患者血清中可溶性Tim-3蛋白（sTim-3）含量高于正常人。人源巨噬細(xì)胞系U937和THP-1 Tim-3信號(hào)通路被阻斷后，NLRP3和IL-1β在mRNA水平的表達(dá)升高；⑥在構(gòu)建的小鼠腹膜炎中，Tim-3-TG組腹膜炎炎癥反應(yīng)程度明顯低于WT組，Tim-3信號(hào)通路阻斷組腹膜炎炎癥反應(yīng)程度明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：⑴Tim-3通過(guò)抑制NLRP3炎性