幽門螺桿菌對(duì)NLRP3炎癥小體活化的作用.pdf

1、目的：研究幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, H.pylori）對(duì)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的活化作用，并初步探討H.pylori活化NLRP3炎癥小體的機(jī)制，闡明NLRP3炎癥小體是否參與了H.pylori誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　方法:將H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639涂布在哥倫比亞血瓊脂平板上，放入三氣培養(yǎng)箱（85％N2，10％CO2，5％O2），37℃培養(yǎng)48～72 h，通過革蘭氏染

2、色、尿素酶試驗(yàn)及PCR擴(kuò)增H.pylori16sRNA基因并測(cè)序鑒定后傳代培養(yǎng)備用；按照H.pylori細(xì)菌數(shù):細(xì)胞數(shù)（感染復(fù)數(shù)，MOI）為100:1、200:1的比例感染胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1，并于6 h和12 h收集細(xì)胞， RT-qPCR(Real-time PCR)檢測(cè) NLRP3、半胱氨酸蛋白酶caspase-1（cysteiny aspartate-specific protease-1，caspase-1）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)

3、樣銜接蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD， ASC）mRNA水平，Western blot檢測(cè)NLRP3炎癥小體中NLRP3、caspase-1及ASC蛋白的表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量。用25 mM的ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）預(yù)處理 GES-1細(xì)胞30 min，再按照MOI為1

4、00:1、200:1加入H.pylori NCTC11639，與細(xì)胞共孵育6 h和12 h，檢測(cè)NAC預(yù)處理對(duì)H.pylori誘導(dǎo)的 NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)以及 IL-1β分泌的影響；將H.pylori按照MOI為100:1、200:1的比例與胃癌細(xì)胞株MKN-45、AGS共孵育，分別于6 h和12 h收集細(xì)胞， RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA和蛋

5、白的表達(dá)水平。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量。
　　結(jié)果：1. H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639培養(yǎng)及鑒定結(jié)果：NCTC11639在哥倫比亞血平板上呈細(xì)小半透明不溶血菌落；經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡觀察，可見H.pylori為革蘭氏陰性菌，菌體細(xì)小、彎曲呈S形；挑取菌落行快速尿素酶試驗(yàn)呈強(qiáng)陽性；提取菌株DNA并進(jìn)行16sRNA的基因擴(kuò)增，電泳可見在550 bp處有一條帶，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)確定為NCTC11

6、639。2. H.pylori感染GES-1細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，無論是感染6 h還是感染12 h， NLRP3、caspase-1及ASC mRNA和蛋白的表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的濃度均隨著感染復(fù)數(shù)的增加而增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但用NAC預(yù)處理GES-1細(xì)胞后， NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的濃度也降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；H

7、.pylori感染6 h和12 h之間，各檢測(cè)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. H.pylori感染腫瘤細(xì)胞株MKN-45、AGS細(xì)胞后，與對(duì)照組比較， NLRP3 mRNA和/或蛋白表達(dá)隨著感染復(fù)數(shù)的增加而增加，但caspase-1和ASC mRNA和/或蛋白的表達(dá)隨著感染復(fù)數(shù)的增加而降低，且MKN-45細(xì)胞不表達(dá)ASC蛋白，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的濃度也隨著感染復(fù)數(shù)的增加而降低，差異有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。H.pylori感染6 h和12 h之間，各檢測(cè)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：1. H.pylori在體外能活化GES-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體，上調(diào)相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1和ASC的表達(dá)，促進(jìn)IL-1β炎癥因子的釋放；2. ROS途徑可能參與H.pylori對(duì) GES-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活；3. H.pylori在體外能上調(diào)胃癌細(xì)胞中NLRP3蛋白的表達(dá)，但抑制其下游子c