去泛素化酶USP1在NLRP3炎癥小體活化中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的
　　NLRP3(nucleotide-bingingdomain-likereceptorprotein3)炎癥小體是由NLRP3、ASC和caspase-1組成的分子平臺，能夠識別來自病原微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs)和胞內(nèi)自身危險(xiǎn)信號—損傷相關(guān)分子模式(damageassociatedmolecularpatterns，DAMPs)后活化

2、，在抗感染等多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥小體作為目前研究最為廣泛、深入的炎癥小體，其活化強(qiáng)度與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如Ⅱ型糖尿病、痛風(fēng)、感染性疾病、動脈粥樣硬化、阿爾茲海默氏病等。因此，NLRP3炎癥小體活化調(diào)控機(jī)制研究對于闡明機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生及調(diào)控的機(jī)理、尋找相關(guān)疾病的免疫調(diào)節(jié)療法具有重要理論意義和應(yīng)用價值。
　　泛素特異性肽酶1(ubiquitinspecificpeptidase1，USP1)作為

3、泛素特異性蛋白酶家族成員之一，具有去除其底物泛素化修飾的功能。已有報(bào)道，USP1可通過其去泛素化酶活性去除包括FANCD2和FANCI等在內(nèi)的多種底物的泛素化修飾，參與DNA損傷修復(fù)過程。USP1還可去泛素化ID(inhibitorsofDNAbinding)蛋白家族成員ID1、ID2和ID3，并穩(wěn)定它們的表達(dá)，從而抑制bHLH介導(dǎo)的分化，維持骨肉瘤的腫瘤干細(xì)胞特性。然而，USP1在免疫系統(tǒng)，特別是固有免疫反應(yīng)中的作用，尚不清楚。

4、>　　本課題擬利用多種免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)及NLRP3相關(guān)疾病模型（急性膿毒血癥、葉酸誘導(dǎo)的急性腎小管壞死等），探討USP1在NLRP3炎癥小體活化中的調(diào)控作用，并闡明其作用的分子機(jī)制;揭示USP1在NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病中的作用，為探尋相關(guān)疾病的免疫調(diào)節(jié)療法提供理論依據(jù)。材料和方法
　　1.USP1對NLRP3炎癥小體活化的影響
　　1.1分別用DMSO和USP1的特異性抑制劑ML-323處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h

5、后，LPS(200ng/ml)刺激6h，最后分別用ATP、Nig處理1h。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-18的分泌情況;用PCR方法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　1.2用不同濃度的ML-323(0，15，30，60uM)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后，LPS(200ng/ml)刺激6h，最后用ATP處理1h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA的方法檢測IL-1β的分泌情況

6、。
　　1.3設(shè)計(jì)并合成USP1特異性siRNA，并使用轉(zhuǎn)染試劑Interferin轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，48小時后，WesternBlot檢測USP1表達(dá)，鑒定USP1siRNA干擾效率，篩選出干擾效率最佳的siRNA片段。用轉(zhuǎn)染試劑Interferin將干擾效率最高的USP1-siRNA及對應(yīng)的Ctrl-siRNA轉(zhuǎn)入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，LPS(200ng/ml)刺激6h，再用ATP刺激1h。采用ELIS

7、A的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌情況。USP1特異性小干擾RNA(siRNA)及對應(yīng)的Ctrl-siRNA轉(zhuǎn)入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，LPS(200ng/ml)刺激4h，最后用ATP刺激1h，提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，PCR檢測IL-1β、IL-6、TNF-α在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　1.4用轉(zhuǎn)染試劑JetPEI將USP1-pcmv-Flag或空載質(zhì)粒pcmv-Flag、NF-κ

8、B報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，LPS(200ng/ml)刺激6h，裂解細(xì)胞，報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析USP1對LPS介導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因活化的影響。
　　1.5使用脂質(zhì)體JetPEI分別將USP1-pcmv-Flag、MyD88、TRIF及對應(yīng)空載質(zhì)粒、NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，24h后裂解細(xì)胞，用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析USP1對MyD88和TRIF介導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因活化的影

9、響。
　　1.6在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，用轉(zhuǎn)染試劑Interferin轉(zhuǎn)入干擾效率最佳的干擾片段USP1-siRNA及對應(yīng)的Ctrl-siRNA，培養(yǎng)48h后，LPS(200ng/ml)刺激不同時間（20min和40min），收集細(xì)胞裂解液，用WesternBlot檢測IκBα的磷酸化情況。
　　1.7用DMSO或ML-323處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后，LPS刺激不同時間(4h和8h)，再用ATP刺激1h，收集細(xì)胞培養(yǎng)

10、上清和細(xì)胞裂解液，細(xì)胞培養(yǎng)上清用超濾管濃縮。用WesternBlot方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中Caspase-1的剪切片段p20及細(xì)胞裂解液中pro-Caspase-1的表達(dá)情況。
　　2.USP1調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的分子機(jī)制
　　2.1USP1對NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)的影響
　　2.1.1用不同劑量的ML-323(0，15，30，60uM)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞或THP-1細(xì)胞4h后，LPS

11、刺激6h，裂解細(xì)胞。WesternBlot方法檢測細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)情況。
　　2.1.2用不同劑量的ML-323(0，15，30，60uM)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞或THP-1細(xì)胞4h后，LPS刺激4h，抽提細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄。用PCR方法檢測NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　2.1.3用轉(zhuǎn)染試劑Interferin在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)

12、胞中轉(zhuǎn)入干擾效率最佳的干擾片段USP1-siRNA及對應(yīng)的Ctrl-siRNA，培養(yǎng)48h后，LPS刺激6h，裂解細(xì)胞。WesternBlot方法檢測細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)情況。
　　2.1.4用轉(zhuǎn)染試劑Interferin在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)入干擾效率最佳的干擾片段USP1-siRNA及對應(yīng)的Ctrl-siRNA，培養(yǎng)48h后，LPS刺激4h，抽提細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄。用PCR方法檢測NL

13、RP3、ASC和Caspase-1等分子在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　2.1.5用轉(zhuǎn)染試劑JetPRIME在THP1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Flag-USP1，去泛素化酶活性缺失點(diǎn)突變質(zhì)粒Flag-USP1-C90S或空載體對照pFlag/cmv，培養(yǎng)24h后，LPS（1ug/ml）刺激6h，裂解細(xì)胞。WesternBlot方法檢測細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)情況。
　　2.1.6分別用DMSO和ML-323

14、處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后，LPS刺激6h，最后用ATP、Nig、poly(dA∶dT)或flagellin刺激1h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。用ELISA的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況
　　2.2USP1與NLRP3、ASC的結(jié)合情況
　　2.2.1在THP1細(xì)胞中，用LPS(1ug/ml)刺激不同時間(0，2h，4h，4h)，用USP1特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀后，WesternBlot檢測USP1與NLRP3、

15、ASC內(nèi)源性的結(jié)合情況。
　　2.2.2在HEK293T細(xì)胞中，用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)入Flag-USP1質(zhì)粒與帶有Myc標(biāo)簽的NLRP3、ASC質(zhì)粒，24h后裂解細(xì)胞，分別用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫共沉淀后，WesternBlot檢測外源性USP1與NLRP3、ASC的結(jié)合情況。
　　2.3USP1對NLRP3和NLRP3、ASC去泛素化作用
　　2.3.1使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將M

16、yc-NLRP3、Myc-ASC質(zhì)粒質(zhì)粒以及泛素質(zhì)粒HA-Ub共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)8h后，ML-323處理HEK293T細(xì)胞4h后繼續(xù)培養(yǎng)16h，通過免疫共沉淀及WesternBlot檢測ML-323對NLRP3和ASC泛素化修飾的影響。
　　2.3.2使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將Myc-NLRP3、Myc-ASC質(zhì)粒，F(xiàn)lag-USP1質(zhì)粒、USP1去泛素化酶活性缺失點(diǎn)突變質(zhì)粒USP1-C90S

17、質(zhì)粒以及泛素質(zhì)粒HA-Ub共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24h后裂解細(xì)胞。用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，再結(jié)合WesternBlot檢測USP1對NLRP3和ASC泛素化修飾的影響。
　　2.3.3使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將Myc-NLRP3、Myc-ASC質(zhì)粒、Flag-USP1、USP1去泛素化酶活性缺失點(diǎn)突變質(zhì)粒USP1-C90S質(zhì)粒以及泛素質(zhì)粒K48-Ub或K63-Ub共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，培

18、養(yǎng)24h后裂解細(xì)胞。用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，再結(jié)合WesternBlot檢測USP1對NLRP3和ASC泛素化修飾形式的影響(K48位偶聯(lián)還是K63位偶聯(lián))。
　　3.WDR48對NLRP3炎癥小體的活化的影響
　　在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，用脂質(zhì)體Interferin轉(zhuǎn)入WDR48的特異性小干擾RNA及對照CtrlsiRNA，培養(yǎng)48h后，LPS(200ng/ml)刺激6h后，收集細(xì)胞裂解液。WesternBlot的方

19、法檢測細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC、WDR48的表達(dá)情況;WDR48的特異性小干擾RNA及對照CtrlsiRNA轉(zhuǎn)入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，LPS(200ng/ml)刺激6h，ATP再刺激1h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況;WDR48的特異性小干擾RNA及對照CtrlsiRNA轉(zhuǎn)入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，LPS(200ng/ml)刺激6h，ATP再刺激1h，收集細(xì)胞培養(yǎng)

20、上清和細(xì)胞裂解液。細(xì)胞培養(yǎng)上清用超濾管濃縮。WesternBlot方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中Caspase-1剪切片段p20及細(xì)胞裂解液中pro-Caspase-1的表達(dá)情況。
　　4.IL-1β及LPS刺激對USP1、WDR48表達(dá)及LPS對USP1細(xì)胞內(nèi)定位的影響
　　4.1在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，用IL-1β刺激不同時間點(diǎn)(0，4，8，12，24h)，裂解細(xì)胞，用WesternBlot方法檢測USP1及WDR48的表達(dá)情

21、況;用LPS刺激不同時間點(diǎn)(0，2，4，8，12，24h)，裂解細(xì)胞，用WesternBlot方法檢測USP1和WDR48的表達(dá)情況。
　　4.2用LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時間(0，15min，30min，60min)，提取胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白，WesternBlot檢測USP1在胞核、胞質(zhì)中的表達(dá)變化。
　　5.USP1特異性抑制劑ML-323在NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病中的作用
　　5.1ML-323在LP

22、S誘導(dǎo)的膿毒血癥模型中的作用
　　C57BL/6小鼠腹腔注射ML-323(10mg/kg)，6h后再腹腔注射LPS(10mg/kg)。2h后取外周血，用ELISA方法檢測外周血血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌情況。
　　5.2ML-323在葉酸誘導(dǎo)的急性腎小管壞死模型中的作用
　　C57BL/6小鼠腹腔注射ML-323，6h注射葉酸(Folicacid，F(xiàn)A，250mg/kg)后:
　　①觀察不同時間

23、點(diǎn)(0，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h)小鼠存活情況。
　　②12h后取外周血，用ELISA方法檢測外周血血清中IL-1β分泌情況。
　?、?6h后，小鼠麻醉處死，取腎臟甲醛固定后HE染色，觀察腎臟腎小管、腎小囊等的結(jié)構(gòu)變化。
　　研究結(jié)果
　　1.USP1促進(jìn)NLRP3炎癥小體的活化
　　USP1特異性抑制劑ML323或USP1的特異性siRNA抑制內(nèi)源性USP1表達(dá)后，小鼠原代腹

24、腔巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體活化引起的IL-1β的分泌均明顯降低，而TNF-α、IL-6的分泌無明顯變化;同時，Caspase-1裂解片段p20表達(dá)也明顯降低。結(jié)果顯示USP1可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的活化。
　　2.USP1促進(jìn)NLRP3、ASC在蛋白水平的表達(dá)
　　USP1特異性抑制劑ML323或USP1的特異性siRNA抑制內(nèi)源性USP1表達(dá)后，小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC蛋白表達(dá)明顯降低，而對NLRP3

25、、ASC在mRNA水平表達(dá)無明顯影響;同時，ML-323也可顯著抑制THP-1細(xì)胞中NLRP3、ASC的蛋白表達(dá)，而對其mRNA水平表達(dá)無明顯影響。以上結(jié)果顯示USP1可促進(jìn)NLRP3和ASC在蛋白水平的表達(dá)。
　　3.USP1特異性結(jié)合NLRP3、ASC
　　在THP1細(xì)胞中，LPS刺激后，USP1與NLRP3、ASC均可內(nèi)源性結(jié)合;在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入外源性USP1和NLRP3或ASC質(zhì)粒后，USP1與NLRP3、

26、ASC均可結(jié)合。以上結(jié)果顯示，USP1可特異性結(jié)合NLRP3和ASC。
　　4.USP1去除NLRP3和ASC的泛素化修飾
　　在HEK293T細(xì)胞中，ML-323處理后，NLRP3和ASC的泛素化修飾均明顯增強(qiáng);USP1高表達(dá)后，NLRP3和ASC的泛素化修飾均明顯減弱，USP1去泛素化酶活性缺失點(diǎn)突變質(zhì)粒USP1-C90S高表達(dá)對NLRP3和ASC的泛素化修飾沒有明顯影響。以上結(jié)果顯示，USP1可通過其去泛素化酶活性特異

27、性去除NLRP3和ASC的泛素化修飾。
　　5.USP1去除NLRP3和ASC的K48偶聯(lián)的泛素化修飾
　　在HEK293T細(xì)胞中，USP1高表達(dá)后，NLRP3和ASC的K48偶聯(lián)的泛素化修飾均明顯減弱，而對K63偶聯(lián)的泛素化修飾均無明顯影響。以上結(jié)果顯示，USP1可通過其去泛素化酶活性特異性去除NLRP3和ASC的K48偶聯(lián)的泛素化修飾。
　　6.WDR48促進(jìn)NLRP3炎癥小體的活化
　　在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)

28、胞中，轉(zhuǎn)入WDR48特異性小干擾siRNA后，NLRP3、ASC表達(dá)明顯減弱，NLRP3炎癥小體活化引起的IL-1β分泌明顯降低，Caspase-1的剪切片段p20表達(dá)明顯減弱。
　　7.IL-1β刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞USP1、WDR48的表達(dá)，LPS可誘導(dǎo)WDR48表達(dá)并促進(jìn)USP1的出核
　　IL-1β刺激可誘導(dǎo)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中USP1和WDR48的表達(dá)。LPS刺激可促進(jìn)WDR48的表達(dá)，并可促進(jìn)USP1由胞核轉(zhuǎn)位進(jìn)入

29、胞質(zhì)。
　　8.USP1抑制劑ML323抑制LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥中IL-1β和TNF-α分泌
　　在LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥動物模型中，與DMSO對照組相比，ML-323處理組外周血血清中IL-1β、TNF-α的分泌明顯降低，而IL-6的分泌無明顯變化。
　　9.USP1抑制劑ML323在急性腎小管壞死模型中的作用
　　在葉酸誘導(dǎo)的急性腎小管壞死動物模型中，與DMSO對照組相比，ML-323處理組小鼠存活率明顯升高、

30、小鼠外周血血清中IL-1β的分泌明顯降低、腎小管損傷程度明顯減弱。
　　結(jié)論
　　1.USP1可特異性結(jié)合NLRP3和ASC，通過其去泛素化酶活性特異性去除NLRP3和ASC的K48偶聯(lián)的泛素化修飾，抑制其降解，穩(wěn)定其蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎癥小體的活化。
　　2.USP1在多種NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病，如內(nèi)毒素血癥、急性腎小管壞死等中均發(fā)揮調(diào)控作用。
　　創(chuàng)新性及研究意義
　　1.發(fā)現(xiàn)了可去除NL