NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、背景:目前冠心病(CAD)已成為發(fā)達(dá)國(guó)家患者死亡的首要原因。以血管壁功能紊亂及斑塊形成為特征的動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病形成及發(fā)展的主要病理過程。內(nèi)皮功能紊亂引起的自由基增加，低密度脂蛋白(LDL)、感染性微生物、剪切應(yīng)力、毒素、高血壓等因素的共同作用會(huì)誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成。慢性炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的重要推動(dòng)力，動(dòng)脈壁的脂質(zhì)沉積以及外周血炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及發(fā)展的主要標(biāo)志。<

2、br>　　 近年來的研究提示先天免疫模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。它們通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)以及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(endogenous danger signals，DAMPs)使免疫細(xì)胞受到活化并分泌一系列的細(xì)胞因子從而促進(jìn)動(dòng)脈

3、壁的炎癥反應(yīng)過程。NLRP3炎癥小體是剛剛引起關(guān)注的一種細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，當(dāng)配體與NLRP3結(jié)合后促進(jìn)炎癥小體的形成，并對(duì)caspase-1進(jìn)行自身激活，最終導(dǎo)致IL-1β和IL-18的成熟及分泌?，F(xiàn)有研究結(jié)果提示NLRP3炎癥小體可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但是部分研究結(jié)論仍然存在矛盾。因此，清楚認(rèn)識(shí)NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，對(duì)于認(rèn)識(shí)細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體在人動(dòng)脈粥樣硬化形成及發(fā)展中的作用具有重

4、要意義。
　　 方法:該實(shí)驗(yàn)主要分為兩大部分:第一部分觀察臨床冠心病患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子的表達(dá)情況。通過ELISA，real-time PCR和Western Blot等方法對(duì)20例健康對(duì)照以及64例不同程度冠心病(穩(wěn)定性心絞痛，不穩(wěn)定性心絞痛)患者外周血單核細(xì)胞NLRP3及其下游炎癥因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);觀察30例急性ST段抬高型心肌梗死患者NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子的

5、動(dòng)態(tài)表達(dá)，共選取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次為:胸痛發(fā)作6小時(shí)以內(nèi)，胸痛發(fā)作后48～72小時(shí)，心肌梗死發(fā)病后1周以及心肌梗死后4～6周，通過ELISA，real-time PCR的方法對(duì)急性ST段抬高型心肌梗死患者發(fā)病不同時(shí)間點(diǎn)的外周血單核細(xì)胞內(nèi)NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行觀察。第二部分，從細(xì)胞水平探討NLRP3炎癥小體的作用，采用ox-LDL、ox-HDL、HDL三種脂蛋白分別作用于人單核細(xì)胞系Thp-1之后，觀察NLRP3及其下游炎癥因子

6、的表達(dá)變化;通過RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建NLRP3小干擾RNA下調(diào)NLRP3基因表達(dá)，再次給予ox-LDL、ox-HDL、HDL，觀察下調(diào)NLRP3基因表達(dá)后對(duì)下游caspase-1、IL-1β和IL-18活化情況的影響;觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304中是否存在NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)，同樣給予ox-LDL、ox-HDL、HDL作用后觀察NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.NLRP3及

7、其下游炎癥因子在冠心病患者中隨冠心病的病情及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度增加而表達(dá)逐漸增加;
　　 2.NLRP3及其下游炎癥因子在急性ST段抬高型心肌梗死發(fā)病過程中的4個(gè)時(shí)間點(diǎn):胸痛發(fā)作6小時(shí)以內(nèi)(3.5±1.1小時(shí))，胸痛發(fā)作后48～72小時(shí)(57.0±9.4小時(shí))，心肌梗死發(fā)病后1周(7±1天)以及心肌梗死后4～6周(5.1±0.7周)具有動(dòng)態(tài)變化;
　　 3.氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，氧化高密度脂蛋白(ox

8、-HDL)作用于單核細(xì)胞后可以促進(jìn)NLRP3表達(dá)，并進(jìn)一步活化NLRP3炎癥小體下游的caspase-1，誘發(fā)IL-1β和IL-18的分泌，這種活化效應(yīng)具有濃度依賴性;高密度脂蛋白(HDL)作用于單核細(xì)胞隨作用濃度的升高NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)逐漸減弱;干預(yù)NLRP3炎癥小體能夠明顯抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生;
　　 4.在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304中存在NLRP3及其下游炎癥因子的mRNA和蛋白水平的表達(dá);給予氧化低密度脂

9、蛋白(ox-LDL)和氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)刺激后，能夠促進(jìn)NLRP3及其下游炎癥因子的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18的釋放。
　　 結(jié)論:
　　 1.NLRP3及其下游炎癥因子在冠心病患者中隨冠心病的病情及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度增加而表達(dá)逐漸增加，提示NLRP3及其下游炎癥因子可能與冠心病的病情及動(dòng)脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度相關(guān);
　　 2.NLRP3及其下游炎癥因子在急

10、性ST段抬高型心肌梗死發(fā)病過程中具有動(dòng)態(tài)變化，提示NLRP3及其下游炎癥因子可能參與了急性ST段抬高型心肌梗死發(fā)病過程中的急性炎癥反應(yīng);
　　 3.在人單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中都存在NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)，在脂蛋白的作用下能夠表現(xiàn)出不同程度的活化和抑制作用，干預(yù)NLRP3炎癥小體能夠明顯抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提示NLRP3炎癥小體在參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，能夠全面參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展