NLRP3炎癥小體在布魯氏菌感染過程中作用的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病是一種世界范圍內(nèi)的人獸共患傳染病,給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來嚴重的危害。由于一直缺乏安全、有效的疫苗和方便快捷、成本低廉的檢測手段,布魯氏菌的預(yù)防和控制工作難以有所突破;加上近年來活畜和畜產(chǎn)品流通頻繁,布魯氏菌在我國的流行已經(jīng)呈現(xiàn)出逐年增長的趨勢。與很多革蘭氏陰性病原菌不同,布魯氏菌的致病機制復(fù)雜,在其侵染巨噬細胞的初始階段不引起強烈的炎癥反應(yīng),也不激活強烈的固有免疫,從而更有利于它們逃避機體固有免疫的殺滅作用。固有免疫是機體

2、抵御病原入侵的第一道防線,炎癥反應(yīng)在機體對抗病原菌入侵時也起到關(guān)鍵作用,它的觸發(fā)和激活往往需要模式識別受體(PRRs)的介導(dǎo),而NLRPs家族是一組重要的模式識別受體,尤其是其成員NLRP3所介導(dǎo)形成的NLRP3炎癥小體,在感受外界病原微生物、大分子異物以及細胞損傷所釋放的一些物質(zhì)等危險相關(guān)分子模式(DAMPs)方面具有重要作用,因此研究NLRP3炎癥小體與布魯氏菌感染的關(guān)系可以為揭示機體對布魯氏菌固有免疫和炎癥反應(yīng)機理提供實驗依據(jù),具

3、有重要意義。
　　目的:搞清楚模式識別受體NLRPs家族在小鼠不同組織和巨噬細胞中的轉(zhuǎn)錄情況,選擇轉(zhuǎn)錄NLRP3的組織和細胞作為研究對象,在細胞水平和機體水平搞清楚NLRP3炎癥小體相關(guān)基因在布魯氏菌感染過程中的轉(zhuǎn)錄和表達變化;探索布魯氏菌LPS對NLRP3炎癥小體的影響;為揭示NLRP3炎癥小體與布魯氏菌感染的關(guān)系提供實驗依據(jù)。
　　方法:反轉(zhuǎn)錄PCR檢測小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、小腸和孕鼠胎盤以及小鼠巨噬細胞RA

4、W264.7中NLRPs基因的轉(zhuǎn)錄情況;建立布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7和人急性淋巴癌細胞THP-1的模型,絕對實時熒光定量PCR檢測布魯氏菌侵染后細胞中NLRP3、ASC、Caspase1、IL1-β、IL18基因的轉(zhuǎn)錄水平;ELISA方法檢測RAW264.7細胞上清中IL1-β、IL18的含量;建立布魯氏LPS與小鼠巨噬細胞RAW264.7作用的模型,相對實時熒光定量PCR檢測NLRP3、ASC、Caspase1、IL1

5、-β、IL18的轉(zhuǎn)錄水平變化。建立布魯氏菌和單增李斯特菌感染小鼠的動物模型,相對實時熒光定量PCR檢測布魯氏菌和單增李斯特菌感染的小鼠肝臟、脾臟和腎臟中NLRP3、ASC、Caspase1、IL1-β、IL18轉(zhuǎn)錄水平的變化,ELISA方法檢測血清中IL1-β、IL18的含量,組織切片技術(shù)觀察上述細菌在肝、脾、腎中引起的病理變化;免疫組織化學(xué)技術(shù)研究ASC蛋白在布魯氏菌感染小鼠的肝臟、脾臟和腎臟中的分布和表達情況。
　　結(jié)果:模式

6、識別受體NLRPs家族的很多成員在小鼠肝臟、脾臟、腎臟、心臟、小腸和胎盤組織中均有轉(zhuǎn)錄,而在小鼠巨噬細胞和小鼠肺臟中則只檢測到NLRP3和NLRP4efg的轉(zhuǎn)錄, NLRP3在小鼠上述組織和巨噬細胞中均有轉(zhuǎn)錄;在布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7和THP-1細胞的前24小時,NLRP3炎癥小體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄大都被短暫抑制,相應(yīng)的RAW264.7細胞上清中IL1-β、IL18的含量也被下調(diào);布魯氏菌2308和RB51的LPS對NLR

7、P3炎癥小體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的最佳上調(diào)濃度在1ng/ml-10ng/ml之間,△WbkA的LPS激活NLRP3炎癥小體的能力較弱,但卻能有效刺激IL1-β和IL18基因的轉(zhuǎn)錄;布魯氏菌2308、RB51、△WbkA和單增李斯特菌感染小鼠后均可引起肝、脾、腎的病理變化,也大都能引發(fā)肝臟、脾臟和腎臟中NLRP3炎癥小體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào),這種上調(diào)多呈現(xiàn)出“波浪狀”變化趨勢;與RB51和單增李斯特菌相比,2308感染對小鼠肝臟、脾臟和腎臟的N