基于大鼠OGD海馬腦片探討芍藥苷對(duì)NLRP3和NLRP1炎癥小體的作用.pdf

1、目的:
　　本研究通過(guò)復(fù)制新生大鼠氧糖剝奪(OGD)海馬腦片模型，觀察芍藥苷對(duì)新生大鼠海馬腦片OGD損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討芍藥苷對(duì)NLRP3和NLRP1炎癥小體組成蛋白及其所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響，從而為芍藥苷在缺血性腦中風(fēng)中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供新的思路。
　　方法:
　　(1)不同時(shí)間OGD損傷對(duì)大鼠海馬腦片的損傷情況:Stoppini法制備新生大鼠海馬腦片培養(yǎng)14d后，將其分為空白對(duì)照組、OGD30mi

2、n組、OGD45min組、OGD60min組?？瞻讓?duì)照組不做任何處理。各OGD組吸棄腦片培養(yǎng)液后，加入1ml PBS，置于94％N2、5％CO2、1％O2、37℃的三氣培養(yǎng)箱中分別孵育30 min、45 min、60 min后，吸棄PBS，更換為1mL腦片培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后取出海馬腦片，采用PI染色法觀察腦細(xì)胞的損傷情況，并檢測(cè)其灰密度值，進(jìn)而尋找OGD造模的最佳時(shí)間;
　　(2)芍藥苷對(duì)OGD海馬腦片的

3、神經(jīng)保護(hù)作用:將海馬腦片分為空白對(duì)照組、OGD模型組、芍藥苷低劑量組（1μM）、芍藥苷中劑量組（10μM）、芍藥苷高劑量組(100μM)，共5組。除空白對(duì)照組外，將其他各組海馬腦片均置于三氣培養(yǎng)箱中按最佳時(shí)間OGD損傷后，給予相應(yīng)的藥物干預(yù)24h，24h后分別采用PI染色法檢測(cè)腦細(xì)胞的損傷情況，并檢測(cè)其灰密度值;
　　(3)芍藥苷對(duì)OGD海馬腦片中NLRP3和NLRP1炎癥小體組成蛋白及其所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響:藥物干預(yù)

4、24h后，ELISA法檢測(cè)腦片培養(yǎng)上清液中炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)情況;TUNEL法檢測(cè)腦片中的細(xì)胞凋亡率;RT-qPCR法檢測(cè)NLRP3、NLRP1、ASC、Casepase-1的基因表達(dá)情況;Western Blot法檢測(cè)NLRP3、NLRP1、ASC、Casepase-1、 Caspase-3、Bax和BcL-2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)以不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行OGD損傷后，OGD30 min后的P

5、I熒光黯淡，較空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05);而OGD45 min、60min后的PI熒光較為明亮，明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，提示OGD45 min后腦細(xì)胞損傷會(huì)明顯加重，其中以O(shè)GD60min組損傷最為嚴(yán)重，且表現(xiàn)出不可逆的趨勢(shì)，故本研究認(rèn)為OGD的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)以45min為宜。
　　(2)與空白對(duì)照組相比，模型組的PI熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01），提示OGD模型復(fù)制成功。給予不同濃度的芍藥苷干預(yù)后PI熒光強(qiáng)度

6、均明顯低于模型組(P＜0.01)，且具有濃度依賴性。
　　(3)與空白對(duì)照組相比，模型組海馬腦片中NLRP3、NLRP1、ASC、Casepase-1的蛋白和基因表達(dá)均有明顯增多(P＜0.01)。芍藥苷高、中劑量組海馬腦片中NLRP1、ASC、NLRP3、Cl.Caspase-1和Pre.Caspase-1的蛋白表達(dá)量較模型組均明顯降低(P＜0.01);芍藥苷高、中、低劑量組海馬腦片中NLRP3、NLRP1、ASC、Casepas

7、e-1基因表達(dá)均明顯低于模型組(P＜0.01)。
　　(4)與空白對(duì)照組相比，模型組IL-1β和IL-18的含量、Cl.Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率均明顯增高，BcL-2的蛋白表達(dá)量明顯減少(P＜0.01)。芍藥苷高劑量組的IL-1β和IL-18表達(dá)含量、Cl.Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率均明顯少于模型組，而BcL-2的蛋白表達(dá)量明顯高于模型組(P＜0.01)。
　　結(jié)論: