芳香烴受體對(duì)NLRP3炎癥小體的調(diào)控效應(yīng)和分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:本課題深入研究了AhR對(duì)NLRP3炎癥小體的調(diào)控效應(yīng)和分子機(jī)制，旨在通過闡明NLRP3分子在轉(zhuǎn)錄水平的分子調(diào)控機(jī)制，為尋找防治環(huán)境污染因素造成的炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)療法提供新途徑。
　　材料和方法:
　　1.AhR對(duì)NLRP3表達(dá)的影響
　　1.1.分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min，再用LPS刺激不同的時(shí)間(O，4h，8h)，Western blot檢測(cè)NLRP3、ASC、caspa

2、se-1和IL-1β在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　1.2.分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min，再用LPS刺激不同的時(shí)間(0，2h，4h)，RT-PCR檢測(cè)NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β在mRNA水平的表達(dá)變化。
　　1.3.用不同劑量的AhR活化劑TCDD(2nM，10nM，20nM，50nM)和FICZ(20nM，100nM，200nM，500nM)分別刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40

3、min，再用LPS刺激8h，Westem blot檢測(cè)NLRP3在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　1.4.設(shè)計(jì)合成AhR特異性小干擾RNA，用轉(zhuǎn)染試劑將靶向AhR的SiRNAAhR-siRNA以及相應(yīng)的對(duì)照CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞沉淀，Western blot檢測(cè)AhR的蛋白表達(dá)情況，明確AhR-siRNA的干擾效率，篩選出抑制效率最佳的干擾片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　1.5.用轉(zhuǎn)染試

4、劑將篩選出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)48h，用LPS對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行刺激，并于不同的時(shí)間點(diǎn)(0，4h，8h)收集細(xì)胞，通過Western blot檢測(cè)NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在蛋白水平的表達(dá)情況。
　　1.6.用轉(zhuǎn)染試劑將篩選出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)48h

5、，用LPS對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行刺激，并于不同的時(shí)間點(diǎn)(0，4h，8h)收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR檢測(cè)NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　2.AhR對(duì)NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因活性的影響
　　2.1.使用脂質(zhì)體分別將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒（nt-2032 tont+166)轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，24h后分別用D

6、MSO和TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。
　　2.2.使用脂質(zhì)體將NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒(nt-2032 to nt+166)轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，24h后分別用DMSO、TCDD、FICZ和L-kynurenine(L-kyn)刺激細(xì)胞40min，再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。
　　2.3.分

7、別將AhR的真核表達(dá)載體pCMV-Myc-AhR和空載體pCMV-Myc轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞株，并篩選鑒定出穩(wěn)定高表達(dá)AhR的細(xì)胞株以及表達(dá)相應(yīng)空載體的細(xì)胞株。向兩種細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染入PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒(nt-2032 to nt+166)，24h后用LPS刺激細(xì)胞6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。
　　3.AhR調(diào)控NLRP3表達(dá)的分子機(jī)制
　　3.1.測(cè)序分析N

8、LRP3啟動(dòng)子區(qū)的堿基序列，發(fā)現(xiàn)NLRP3啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)潛在的AhR結(jié)合序列，分別為XRE1(nt-1512to-1504)、XRE2(nt-911 to-904)和XRE3(nt+61 to+67)。構(gòu)建一系列含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的不同報(bào)告基因質(zhì)粒，包括:①含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)域的截?cái)囿w質(zhì)粒-2032(nt-2032 to nt+166)、-1434(nt-1434to nt+166)和-1113(nt-1113 tont+1

9、66);②AhR結(jié)合序列缺失的NLRP3啟動(dòng)子區(qū)突變體質(zhì)粒ΔXRE-1、AXRE-2和ΔXRE-3;③AhR結(jié)合序列突變(GCGTG突變?yōu)锳TACA)的NLRP3啟動(dòng)子區(qū)質(zhì)粒mt-1、mt-2和mt-3。
　　3.2.使用脂質(zhì)體將PGL3質(zhì)粒和包含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同截?cái)囿w的報(bào)告基因質(zhì)粒-2032，-1434，-1113分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)24h后用DMSO和TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基

10、因系統(tǒng)檢測(cè)分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。
　　3.3.使用脂質(zhì)體將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒-2032，或其AhR結(jié)合序列缺失的突變體質(zhì)粒ΔXRE-1、ΔXRE-2和ΔXRE-3分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，用DMSO、TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。
　　3.4.使用脂質(zhì)體將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基

11、因質(zhì)粒-2032，或其AhR結(jié)合序列突變的突變體質(zhì)粒mt-1、mt-2和mt-3分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)24h后用DMSO和TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。
　　3.5.用DMSO、TCDD和FICZ刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞1h，應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AhR與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。
　　3.6.用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-

12、siRNA或CTRL-siRNA分別轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)48h后分別用DMSO、TCDD和FICZ刺激1h，應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AhR與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。
　　4.AhR對(duì)NLRP3炎癥小體活化效應(yīng)的影響
　　4.1.用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min，之后用LPS刺激8h，再分別用ATP、nigericin(Nig)和Alum刺激30min。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)

13、胞培養(yǎng)上清，細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中caspase-1的剪切和IL-1β的分泌，以及細(xì)胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和NLRP3的表達(dá)情況。
　　4.2.用轉(zhuǎn)染試劑將AhR-siRNA或CTRL-siRNA分別轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)48h后用LPS刺激8h，再分別用ATP和Nig刺激30min。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清，細(xì)胞上清用超濾管

14、進(jìn)行濃縮。Western blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中caspase-1和IL-1β的分泌，以及細(xì)胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和NLRP3的蛋白表達(dá)情況。
　　4.3.用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min，之后用LPS刺激不同的時(shí)間（4h和8h），再分別用ATP、Nig和Alum刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　

15、　4.4.用不同劑量的TCDD(2nM，10nM，20nM，50nM)刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min，之后用LPS刺激8h，再分別用ATP和Nig刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　　4.5.分別用DMSO、TCDD、FICZ和L-kyn刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min，之后用LPS刺激8h，再用ATP刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中I

16、L-1β的分泌情況。
　　4.6.用LPS分別刺激pCMV-Myc-AhR質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和pCMV-Myc空載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系8h，之后用ATP刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　　4.7.用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA和CTRL-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)48h后分別用DMSO和TCDD刺激40min，之后用LPS刺激8h，再分別用AT

17、P、Nig和Alum刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究AhR活化對(duì)明礬誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎的影響。
　　結(jié)論:
　　1.AhR的活化能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。
　　2.AhR能夠與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的XRE序列結(jié)合，抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄。
　　3.AhR的活化能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體的活化。