NLRP3炎性體在HBV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭中的作用.pdf

1、目的：
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）相關(guān)慢加急性肝功能衰竭（acute on chronic liver failure, ACLF）是在慢性乙型肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死、凋亡，繼而引起嚴(yán)重的肝功能損害和各種并發(fā)癥的臨床綜合征。其病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，預(yù)后不良。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與免疫損傷密切相關(guān)。有研究稱：在肝衰竭患者的外周血中存在“免疫紊亂”狀態(tài)，但目前尚無確切的指標(biāo)能夠明確

2、患者的免疫狀態(tài)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NACHT-LRR-PYD-containing proteins3, NLRP3）炎性體是一種多蛋白復(fù)合體，屬于固有免疫系統(tǒng)，通過識別外源性及內(nèi)源性損傷因子發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)其在急性肝衰竭發(fā)揮促炎作用，但其在HBV相關(guān)ACLF中的作用尚未闡明。本研究通過檢測HBV相關(guān)ACLF患者外周血、肝組織中NLRP3、Caspase-1及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin, IL-1β

3、）、IL-18的表達(dá)，初步探討NLRP3炎性體在HBV相關(guān)ACLF患者中的作用。
　　方法：
　　選取2016年1月至2016年10月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院門診或住院患者，HBV相關(guān)ACLF患者30例（ACLF組）、CHB患者30例（CHB組）和健康體檢者15例（健康對照組）。此外，收集接受肝移植的HBV相關(guān)ACLF患者肝組織8例、肝組織活檢的CHB患者肝組織8例和正常供體肝組織5例。檢測入組患者血清ALB、ALT、AST、T

4、B、DB、INR、HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平。流式細(xì)胞學(xué)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中NLRP3的表達(dá)量及表達(dá)位置。實(shí)時(shí)熒光定量（quantitative real-time）PCR檢測PBMC、肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA的表達(dá)，并對PBMC進(jìn)行磁珠分選，應(yīng)用RT-qPCR分別檢測CD14+單核細(xì)胞、CD

5、14-PBMC細(xì)胞群中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色法檢測肝組織中NLRP3的表達(dá)以及與CD68共同表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1一般資料：各組研究對象年齡、性別比例具有可比性。ACLF組患者血清ALT、AST、TB、DB、INR水平明顯高于CHB組及健康對照組（P<0.01）；ACLF組患者 ALB、HBV DNA水平明顯低于CHB組（P<0.01）。
　　2乙型

6、肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝功能衰竭組外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)下降
　　應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析各組患者外周血單核細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)水平（MFI），結(jié)果顯示：ACLF組NLRP3的表達(dá)量明顯低于CHB組和健康對照組（P＜0.01）。CHB組NLRP3的表達(dá)亦低于健康對照組（P＜0.01）。進(jìn)一步分析ACLF中晚期和ACLF早期患者單核細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)，結(jié)果顯示：ACLF中晚期患者明顯低于ACLF早期患者（P＜0.01）

7、。
　　應(yīng)用RT-qPCR檢測PBMC中NLRP3的表達(dá)，結(jié)果顯示：ACLF組NLRP3 mRNA水平低于CHB組和健康對照組（P＜0.05）。CHB組NLRP3 mRNA的表達(dá)亦低于健康對照組（P＜0.01）。
　　3 NLRP3主要表達(dá)在CD14+CD16+單核細(xì)胞群
　　NLRP3在單核細(xì)胞亞群中的表達(dá)：在CD14++CD16-單核細(xì)胞群和CD16++CD14-單核細(xì)胞群，ACLF組、CHB組、健康對照組中NLR

8、P3的表達(dá)未見明顯差異（P＞0.05）；在CD14+CD16+單核細(xì)胞群，ACLF組、CHB組均低于健康對照組（P＜0.01），ACLF組NLRP3的降低最為明顯，尤其是ACLF中晚期患者。同時(shí)，應(yīng)用CD14磁柱分離PBMC，分別檢測CD14+單核細(xì)胞、CD14-PBMC中NLRP3 mRNA水平。ACLF組、CHB組CD14+單核細(xì)胞中NLRP3 mRNA水平明顯低于健康對照組（P＜0.05），以ACLF組降低顯著。而三組在CD14-

9、PBMC細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)未見明顯差異（P＞0.05）。
　　4乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝功能衰竭組肝組織中NLRP3的表達(dá)升高
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：ACLF組肝組織中NLRP3的表達(dá)明顯高于CHB組（P＜0.01），健康對照組肝組織未見NLRP3表達(dá)。NLRP3在匯管區(qū)與小葉內(nèi)均有表達(dá)，以小葉內(nèi)為主，CD68與NLRP3共染提示：NLRP3主要表達(dá)于肝小葉內(nèi)kupffer細(xì)胞胞漿。
　　RT-

10、qPCR檢測肝組織中NLRP3 mRNA的表達(dá)顯示：ACLF組NLRP3 mRNA的表達(dá)高于CHB組和健康對照組（P＜0.01）。CHB組NLRP3mRNA的表達(dá)亦高于健康對照組（P＜0.01）。
　　5乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝功能衰竭組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá)下降
　　RT-qPCR檢測PBMC中Caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá)顯示：ACLF組Ca

11、spase-1、IL-1βmRNA水平均低于CHB組Caspase-1、IL-1β水平，IL-18 mRNA于兩組未見明顯差異（P＞0.05），ACLF組與健康對照組mRNA水平未見明顯差異（P＞0.05）。
　　PT-qPCR檢測CD14磁珠分選后Caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá)顯示：ACLF組CD14+單核細(xì)胞Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表達(dá)低于CHB組Caspase-1、IL

12、-1β、IL-18 mRNA水平，ACLF組CD14-PBMC中Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表達(dá)低于CHB組Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表達(dá)。ACLF組與健康對照組未見明顯差異（P＞0.05）。
　　6乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝功能衰竭組肝組織中Caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá)升高
　　RT-qPCR檢測肝組織中Caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β

13、、IL-18mRNA的表達(dá)顯示：ACLF組IL-1βmRNA、IL-18mRNA的表達(dá)均高于CHB組及健康對照組（P＜0.05或P＜0.01）。ACLF組Caspase-1mRNA的表達(dá)與CHB組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　7 ACLF組患者CD14+CD16+單核細(xì)胞NLRP3的表達(dá)量與患者M(jìn)ELD評分呈負(fù)相關(guān)（R=-0.74），相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1 NLRP3炎性體在