NLRP3炎性復合體在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后表達及作用機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，其可直接破壞顱內(nèi)結(jié)構(gòu)，導致患者神經(jīng)系統(tǒng)功能嚴重受損，甚至可出現(xiàn)植物生存狀態(tài)或危及生命。尤其是中、重型顱腦外傷對患者的生存時間、神經(jīng)功能的影響巨大。隨著經(jīng)濟及交通的發(fā)展，創(chuàng)傷性顱腦損傷的發(fā)生率逐年上升，較高的致殘率和死亡率已使其成為影響人類健康的首要因素，并越來越多的引起臨床醫(yī)生及科研學者的重視。近年來，科研工作者們從不同角度對顱腦損傷的

2、發(fā)生原因、生物力學機制、病理生理學、病理形態(tài)學及分子病理學變化等方面進行了廣泛而深入的研究，并取得了很大的進步，新的理論不斷產(chǎn)生和發(fā)展，但是目前仍然沒有明顯有效的治療措施能減少死亡率和致殘率。
　　 TBI后的復雜的病理生理過程及其精確的調(diào)控機制至今仍然不完全清楚。目前認為，TBI后腦的損傷可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷。原發(fā)性腦損傷主要包括:腦震蕩、彌漫性軸索損傷、腦挫裂傷、外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血(Traumaticsubar

3、achnoid hemorrhage，tSAH)等。另外，繼發(fā)性腦損傷已經(jīng)被證明在外傷后的一系列病理過程中起著關(guān)鍵作用。盡管二次腦損傷的精確機制尚未完全研究清楚，但炎癥反應已經(jīng)被證實在繼發(fā)性腦損傷中起著關(guān)鍵作用。
　　 細胞因子是由活化細胞產(chǎn)生和分泌的能夠影響其他細胞或分泌細胞自身生長、分化和增值，并且與免疫活化和炎癥反應具有重要關(guān)系的一類可溶性多肽遞質(zhì)，它包括白細胞介素(ILs)、趨化因子、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IN

4、F)、集落刺激因子(CSF)、生長因子(GH)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NFS)、神經(jīng)生成素等。正常情況下，其含量極微，但在各種因素刺激下表達可急劇增加。細胞因子IL-1β作為一種免疫反應的使動因子，已經(jīng)被證明在腦外傷后的炎癥級聯(lián)反應的產(chǎn)生和發(fā)展中扮演著重要角色。IL-1β的損傷作用不僅僅是表現(xiàn)在它自身，更重要的是IL-1β能激活其他促炎反應通路，產(chǎn)生大量炎癥因子，如TNF-α。大量的研究已經(jīng)證實無論是在人類還是嚙齒動物中，早期腦損傷后的腦脊液及

5、腦實質(zhì)中IL-1β的表達量明顯升高。而相關(guān)證據(jù)顯示IL-1β主要由免疫系統(tǒng)激活生殖系編碼的模式識別受體(Pattern Recognition Receptors，PRRs)產(chǎn)生。
　　 PRRs不僅存在于經(jīng)典的免疫細胞內(nèi)，同時也在存在于一些非免疫細胞中。它能夠識別一系列的分子模式產(chǎn)生生物學效應。這些分子模式主要分為兩大類:病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP

6、s)，如脂多糖(LPS)，肽聚糖(PGN)，鞭毛蛋白和微生物的核酸等;以及危險相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），如與組織、細胞損傷等密切相關(guān)的內(nèi)源性危險信號。目前認為PRRs家族的成員可分為四類:Toll樣受體家族，TLRs(the toll-like receptor system)pRIG樣受體家族，RLRs(the RIG-I-likereceptors);C型凝

7、集素受體家族，CLRs(the C-type lectin receptors); NOD樣受體家族，NLRs(nucleotide-binding domain leucine-rich repeats)。
　　 NLRs是一組存在于胞內(nèi)的特殊蛋白質(zhì)，對炎癥反應和免疫反應起關(guān)鍵作用。NLRs家族的一些成員可以聚合形成被稱作“炎性復合體”的多蛋白復合物。炎性復合體能夠活化半胱氨酸蛋白酶-1（Cysteine—requiring

8、Aspartate protease1，Caspase-1）。眾所周知，半胱氨酸蛋白酶或稱半胱天冬蛋白酶，是調(diào)節(jié)炎癥反應以及細胞凋亡的一類蛋白酶家族。正常情況下，它以一種無活性的前體形勢存在，其激活依賴于炎性復合體被外源入侵微生物或者由組織損傷產(chǎn)生的內(nèi)源性危險信號激活后將無活性pro-caspase-1轉(zhuǎn)變成有活性的caspase-1，從而使促炎細胞因子IL-1β成熟并分泌，參與炎癥反應。
　　 NLRP3(Nucleotide

9、-binding domain, leucine-rich repeat, pyrin domaincontaining3）炎性復合體是NLRs家族中被研究最廣泛的成員之一，它的構(gòu)成包括:NLRP3骨架、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptotic speck-containing protein，ASC)、Pro-easpase-1。有研究顯示NLRP3炎性復合體可被多種DAMP及PAMP激活并與包括阿爾茲海默病(Alzheimer's d

10、isease，AD)、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington'sdisease，HD)、肺炎球菌性腦膜炎在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，而NLRP3炎性復合體在星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞中存在。星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞對維持腦組織正常生理功能，應對損傷或疾病方面起著重要作用。在病理情況下，IL-1β被星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞迅速的合成、釋放。然而，有研究表明神經(jīng)元同樣與腦外傷后涉及IL-1β的炎癥反應有所牽連。Keane RW等人已經(jīng)報道了

11、NLRP1炎性復合體在腦外傷神經(jīng)元細胞中的表達及其可能的作用。因此，我們假設NLRP3炎性復合體可能參與了TBI后炎癥反應的發(fā)生于調(diào)控。據(jù)我們所知，目前NLRP3炎性復合體在TBI后腦組織中的表達尚未有文獻報道，基于此，我們設計了本項課題，通過建立大鼠TBI模型，及雙氧水(H2O2)刺激星形膠質(zhì)細胞的體外細胞損傷模型，來研究TBI后NLRP3炎性復合體的表達，并闡明其在二次腦損傷中潛在的作用機制。
　　 目的:
　　 1

12、.體內(nèi)實驗:
　　 通過建立大鼠TBI模型，測定創(chuàng)傷后皮層NLRP3、ASC、Caspase-1的表達量，觀察創(chuàng)傷皮層組織形態(tài)學改變及NLRP3炎性復合體的細胞定位，檢測下游IL-1β的水平，闡明NLRP3在TBI后炎癥反應中的作用。
　　 2.體外實驗:
　　 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，以雙氧水刺激，建立細胞損傷模型，檢測NLRP3炎性體在體外細胞中的表達，結(jié)合體內(nèi)實驗，明確NLRP3炎性體在神經(jīng)細胞炎癥反應中的潛

13、在作用。
　　 方法:
　　 1.體內(nèi)實驗部分
　　 1.1分組及模型
　　 SD成年雄性大鼠（250-300g）72只，采用改進的Feeney's自由落體撞擊方法制作重型TBI模型。將大鼠以每千克體重50毫克計量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切開頭皮，在右側(cè)頂骨處以牙鉆打開一個直徑約5mm的骨窗，同時保證硬腦膜的完整。骨窗的中心點位置在前囪后1.5mm，中線旁開2.5mm處。然后把大鼠固定住立體定位儀上，以

14、40克圓柱形撞擊錘從25cm高度沿垂直金屬桿自由下落，建立損傷模型。同時假手術(shù)組僅僅打開骨窗。
　　 將72只SD大鼠隨機分為6組（每組12只）:正常對照組(normal group)、假手術(shù)組（sham group）、創(chuàng)傷性腦損傷組（TBI組）。其中TBI組又按時間點分為:6小時組、1天組、3天組、7天組。在對應的時間點給予SD大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，以預冷的磷酸鹽緩沖鹽水進行左心室灌注，然后斷頭，收集挫傷周圍的腦組織并立

15、即保存在液氮中，存放于-80℃直到使用為止。依據(jù)之前的實驗分析，假手術(shù)組在任何時間點的取材其待測變量變化無明顯統(tǒng)計學差異，所以我們統(tǒng)一在大鼠開骨窗后6小時取材，并設為假手術(shù)組。
　　 1.2全蛋白提取及Western Blot檢測NLRP3，ASC，Caspase1表達
　　 將所有標本以預冷的PBS沖洗干凈。分別加入RIPA緩沖液(1％ NP40，0.5％sodium deoxycholate,0.1％ SDS,1mM

16、 EDTA,1mM EGTA,1 mM Na3VO4,20mMNaF,0.5 mM DTT,1 mM PMSF, and protease inhibitor cocktail in PBS pH7.4)在冰上進行勻漿。4℃，12000g，離心15分鐘，取上清液進行蛋白定量，加入凝膠電泳上樣緩沖液95℃變性5分鐘。選用10％ SDS-PAGE凝膠，每孔上樣100μg。凝膠電泳（濃縮膠120 V，分離膠60 V）后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(1

17、00 V，90 min)。甲醇浸泡1分鐘后，5％脫脂奶粉（TBST稀釋）室溫下封閉2h，加入兔抗大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1抗體(1/200)、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體(1/2000)4℃孵育過夜。洗脫，用HRP標記的二抗(1/5000)室溫孵育1小時。使用ECL(1/1)化學發(fā)光檢測，曝光、顯影、定影。
　　 1.3免疫共沉淀測定ASC與NLRP3的結(jié)合
　　 依據(jù)上述方法提取全蛋白。取100μg

18、蛋白加入兔抗大鼠ASC抗體（1-2μg/100-500μg蛋白），4℃孵育過夜。加入40μl蛋白G，在水平搖床上，4℃，孵育3小時。1000g離心5分鐘，棄去上清。以免疫沉淀緩沖液洗蛋白G連接的抗原抗體復合物，離心2-3分鐘，棄上清。重復此步驟至少5次。以50μl免疫共沉淀洗脫液將抗原抗體復合物從蛋白G上洗脫下來，離心，收集上清。另用50μl洗脫液孵育膠5分鐘，離心，收上清。將兩個上清混合。跑電泳，轉(zhuǎn)膜，并以兔抗NLRP3抗體檢測。反之

19、，以NLRP3抗體拉沉淀，后用ASC抗體檢測目標蛋白。同時以免疫前血清作為對照。
　　 1.4實時定量PCR(Quantitative real-time PCR)檢測NLRP3、ASC、Caspase-1表達水平
　　 按每50～100mg腦組織加1ml Trizol試劑進行組織勻漿，在去RNA酶環(huán)境下提取總RNA后，用核酸測定儀檢測RNA濃度（OD260/280比值），提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄儀逆轉(zhuǎn)錄成eDNA，-20℃

20、保存。以20μl反應體系(2μl cDNA，0.4μl ROXReference Dye，10μl SYBR Green I，1μl引物，余為DDH2O)進行實時定量PCR。最佳的反應條件是反應40個循環(huán)，每個循環(huán)各期時間為:95℃，30秒;60℃，32秒;72℃，30秒。實驗一主孔兩副孔，以CT值為衡量指標，以每個目的基因與β-actin基因的比值得出不同時間點各個目的基因相對表達水平。公式為:R=2[△Ct target(Norma

21、l-TBI)-△Ct actin(Normal-TBI)]。
　　 1.5免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)檢測NLRP3、ASC、Caspase-1的表達及細胞定位
　　 10％福爾馬林溶液浸泡的腦組織，以損傷灶為中心，常規(guī)石蠟包埋后進行連續(xù)切片，切片厚度4μm，脫蠟，水化，抗原修復后，正常動物非免疫血清封閉。加入兔抗大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1一抗4℃孵育過夜（一抗稀釋比例

22、1/50），洗片后加入1.6％H2O2封閉10分鐘，再加入HRP標記二抗室溫下孵育60分鐘后，DAB顯色。
　　 1.6免疫熒光雙標(Immunofluorescent Double Labeling)檢測NLRP3、ASC、Caspase-1的表達及細胞定位
　　 4％的多聚甲醛浸泡腦組織，然后分別用20％及30％的蔗糖溶液脫水。OCT膠包埋后連續(xù)切片，厚度為4μm。0.1％ Triton x-100室溫孵育1小時，5

23、％胎牛血清封閉1小時。后用封閉液稀釋的兔抗大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1抗體(1∶50)p小鼠抗大鼠NeuN、GFAP、Iba1抗體(1∶100)4℃孵育過夜。PBS輕輕洗到一抗，同時加入Alexa Fluor594山羊抗大鼠二抗(1∶200); Alexa Fluor488山羊抗小鼠二抗(1∶200)室溫孵育1小時。另外加入DAPI對細胞核進行染色。用不加一抗的封閉液作為陰性對照。所有實驗步驟避光操作。熒光顯微鏡觀察并拍照

24、。
　　 1.7酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)細胞因子IL-1β水平
　　 依據(jù)1.2方法提取全蛋白，進行蛋白定量，依據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。加樣:每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃，120分鐘。洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘

25、。洗板:同前。每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。洗板:同前。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘。每孔加入100ul終止液混勻。30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。繪制標準曲線，以測得OD值，參考標準曲線計算IL-1β含量。以皮克每克蛋白質(zhì)表示其含量。
　　 1.8統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料結(jié)果以例數(shù)、均數(shù)±標準差((x)±sd)表示

26、。采用單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義時進行兩兩組間多重比較，若方差齊性，采用LSD檢驗，若方差不齊用Dunnett's T3檢驗。以P≤0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.體外實驗部分
　　 2.1星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)
　　 取出生后1天的SD大鼠，斷頭，取雙層大腦皮層，去除軟腦膜和血管，然后將腦組織剪碎，并以0.5％的胰酶，37℃，孵育5分鐘。用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心

27、，去除上清，以含20％胎牛血清，1％雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，37℃，5％二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。1小時后，將上層培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，可去除大部分雜細胞。然后每2-3天換半液，7-10天后細胞發(fā)生融合。在37℃恒溫搖床中，以150g/分鐘速度振蕩6小時。棄去上清，將余下的貼壁細胞消化后傳代培養(yǎng)，此時絕大多數(shù)細胞為星形膠質(zhì)細胞。細胞傳代2-3次后，即可使用。
　　 2.2以雙氧水刺激細胞損傷模型
　　

28、 隨機將培養(yǎng)的細胞分為6組，正常對照組不加H2O2刺激，H2O2組以100μMH2O2刺激細胞，并分為:1小時、6小時、12小時、24小時、36小時組。在37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2.3全蛋白提取及Western Blot檢測NLRP3，ASC表達
　　 方法同體內(nèi)實驗部分1.2
　　 2.4實時定量PCR(Quantitative real-time PCR)檢測NLRP3、ASC、Caspa

29、se-1表達水平
　　 方法同體內(nèi)實驗部分1.4
　　 2.5免疫熒光(Immunofluorescent)檢測NLRP3、ASC、Caspase-1的表達
　　 將透明玻璃片放入培養(yǎng)板中進行細胞培養(yǎng)，制作細胞爬片。4％的多聚甲醛孵育細胞爬片10分鐘。0.1％ Triton x-100室溫孵育15分鐘，1％胎牛血清封閉1小時。用封閉液稀釋的兔抗大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1抗體(1∶50);小鼠抗大鼠

30、GFAP抗體(1∶100)孵育2小時。PBS輕輕洗到一抗，加入Alexa Fluor594山羊抗大鼠二抗(1∶200)，室溫孵育1小時。另外加入DAPI對細胞核進行染色，不超過1分鐘。用不加一抗的封閉液作為陰性對照。所有實驗步驟避光操作。熒光顯微鏡觀察并拍照。
　　 結(jié)果:
　　 1.體內(nèi)實驗部分:
　　 1.1挫傷周圍腦組織NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達水平
　　 NLRP3的mR

31、NA水平在損傷后6小時迅速升高，24小時下降，然后逐漸增高并在7天達到最高。ASC的mRNA水平在損傷后逐漸升高，于第3天達到頂峰，隨后下降。Caspase-1的mRNA水平在損傷后逐漸升高，在第7天達到頂峰。
　　 1.2挫傷周圍腦組織NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表達水平
　　 NLRP3、ASC、Caspase-1-10、Caspase-1-45的蛋白水平損傷后均逐漸升高，并在第7天表達最高。

32、　　 在損傷后第3天，免疫共沉淀結(jié)果顯示ASC與NLRP3復合物的存在。
　　 1.3免疫組化分析NLRP3、ASC、Caspase-1
　　 損傷后第3天腦組織免疫組織化學結(jié)果顯示，損傷側(cè)挫傷灶周圍腦組織中表達NLRP3、ASC、Caspase-1的陽性細胞數(shù)明顯多于對側(cè)腦組織細胞。陽性細胞主要為神經(jīng)元樣細胞以及膠質(zhì)樣細胞。
　　 1.4免疫熒光分析NLRP3、ASC、Caspase-1
　　 損傷后

33、第3天腦組織免疫熒光雙標結(jié)果顯示，損傷側(cè)挫傷灶周圍神經(jīng)元細胞數(shù)量較對側(cè)明顯減少;損傷側(cè)星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞較對側(cè)增生、肥大，熒光強度較高。NLRP3、ASC、Caspase-1在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞中均有表達。其損傷側(cè)表達量均較對側(cè)腦組織明顯增多，其中NLRP3及ASC主要在包漿中表達，而Caspase-1在包漿及胞核中均有表達。
　　 1.5酶聯(lián)免疫吸附測定挫傷周圍腦組織IL-1β含量
　　 損傷后挫傷

34、周圍腦組織中IL-1β表達量在短時間內(nèi)迅速升高，6小時達到高峰，然后開始逐漸降低，7天時IL-1β表達量與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 2.體外實驗部分
　　 2.1 H2O2誘導膠質(zhì)細胞損傷后NLRP3、ASC蛋白水平變化
　　 雙氧水刺激后，NLRP3的蛋白水平在損傷后逐漸升高，于第6小時達到項峰，隨后下降。但各時間點蛋白表達水平均較對照組顯著增高。
　　 雙氧水刺激后，ASC的蛋白水平在損傷后

35、逐漸升高，于第12小時達到頂峰，隨后下降。但各時間點蛋白表達水平均較對照組顯著增高。
　　 2.2 H2O2誘導膠質(zhì)細胞損傷后NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平變化
　　 雙氧水刺激后，NLRP3mRNA水平在損傷后逐漸升高，于第12小時達到頂峰，隨后下降。但各時間點mRNA表達水平均較對照組顯著增高。而ASC、Caspase-1水平損傷逐漸升高，在6小時達到高峰，隨后逐漸下降，各時間點mRNA水平均明

36、顯高于對照組。
　　 2.3細胞免疫熒光觀察NLRP3炎性復合體表達
　　 免疫熒光結(jié)果顯示，損傷組NLRP3、ASC、Caspase-1熒光表達強度均高于對照組。其中NLRP3及ASC在包漿表達，胞核不表達;Caspase-1主要在包漿表達，胞核有部分表達。
　　 結(jié)論:在TBI后繼發(fā)性腦損傷中，免疫反應與炎癥反應具有重要作用。我們在大鼠挫傷周圍腦組織中發(fā)現(xiàn)NLRP3、ASC及Caspase-1的表達較對照組明

37、顯增高;外傷后NLRP3與ASC聚合形成復合體;Caspase-1在表達增高的同時發(fā)生裂解活化，生成10Kda片段;下游細胞因子IL-1β大量產(chǎn)生。另外我們發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體在腦神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞中均有表達，并通過體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，建立雙氧水細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性復合體在膠質(zhì)細胞損傷后表達升高。綜合分激活了NLRP3，使NLRP3與ASC結(jié)合并募集無活性的Caspase-1前體，使其裂解為活化的Caspas