腺苷A2A受體在創(chuàng)傷性顱腦損傷中的雙向作用及機(jī)制研究.pdf

1、現(xiàn)代社會，創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumaticbraininjury,TBI)具有高發(fā)生率、高致殘率及高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人類生命及生活質(zhì)量。顱腦創(chuàng)傷的損害分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者無法逆轉(zhuǎn)，而后者卻是可逆并對預(yù)后具有決定性作用。目前，對于繼發(fā)性損傷機(jī)制的認(rèn)識主要有興奮性氨基酸毒性、過度炎癥以及鈣超載三方面。顱腦創(chuàng)傷后，損傷組織由于ATP的崩解而釋放大量腺苷并激活腺苷受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。而近來研究發(fā)現(xiàn)，腺苷A2A受體活化可以通

2、過調(diào)節(jié)谷氨酸釋放、炎性反應(yīng)及鈣離子內(nèi)流而在多種中樞損傷模型(如：帕金森氏病模型、缺血性腦損傷模型及興奮性毒性腦損傷模型等)中發(fā)揮保護(hù)或加重?fù)p傷的雙向作用。但是，就A2A受體在顱腦創(chuàng)傷中的作用，少有報道。 因此，為闡明A2A受體在顱腦創(chuàng)傷中是否同樣存在雙向作用以及其作用的機(jī)制，在本研究中，我們首先利用重力撞擊致傷法構(gòu)建了小鼠TBI模型并在TBI后15min、3h、6h和12h分別應(yīng)用A2A受體激動劑CGS21680和拮抗劑ZM24

3、1385處理TBI小鼠，觀察了其對TBI后24h時的傷情的影響，結(jié)合對小鼠TBI后24h內(nèi)腦脊液谷氨酸濃度的動態(tài)檢測，分析其作用與內(nèi)環(huán)境谷氨酸濃度的關(guān)系。然后，我們檢測了體外實驗中，不同濃度(0，0.1，0.5和5.0mmol/L)谷氨酸條件下，小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞及中性粒細(xì)胞上A2A受體活化后分別對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NOS產(chǎn)生及LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA表達(dá)的影響，并探討了其可能涉及的主要信號通路；進(jìn)而通過觀察聯(lián)合應(yīng)用谷氨酸釋放抑制

4、劑及A2A受體激動劑對小鼠TBI模型傷情的影響，以期通過細(xì)胞及整體動物實驗闡明谷氨酸調(diào)控A2A受體雙向作用的具體機(jī)制。最后，為證實骨髓來源細(xì)胞上的A2A受體是否是谷氨酸調(diào)控的主要靶標(biāo)，我們利用骨髓移植的方法構(gòu)建了選擇性敲除及選擇性重建骨髓來源細(xì)胞上A2A受體的小鼠模型，并觀察了其對傷后內(nèi)環(huán)境中存在較高濃度谷氨酸的TBI及無谷氨酸存在的ALI的傷情影響。 主要實驗結(jié)果及結(jié)論： 1、在較低谷氨酸濃度的TBI后3h時間點(diǎn)，激活

5、A2A受體產(chǎn)生保護(hù)，拮抗A2A受體加重?fù)p傷；而在較高濃度的TBI后15min、6h時間點(diǎn)，激活A(yù)2A受體則加重?fù)p傷，反而拮抗A2A受體產(chǎn)生保護(hù)；而在谷氨酸濃度達(dá)到峰值的TBI后12h時間點(diǎn)激活A(yù)2A受體使傷情加重更為劇烈，甚至引起動物死亡，但拮抗A2A受體卻不再具有明顯保護(hù)作用。這提示A2A受體活化后效應(yīng)的走向與內(nèi)環(huán)境中谷氨酸濃度的高低存在密切聯(lián)系。進(jìn)一步對各組TBI后24h時腦脊液中谷氨酸濃度及炎性因子表達(dá)的檢測結(jié)果表明：激活或拮抗A

6、2A受體對傷情的加重或減輕與其對腦脊液中谷氨酸濃度及炎性因子TNF-α、IL-1的表達(dá)的上調(diào)或降低基本成正相關(guān)。根據(jù)神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞上A2A受體活化促谷氨酸釋放的文獻(xiàn)報道，以上結(jié)果初步提示：低濃度谷氨酸時激活A(yù)2A受體可能主要通過抑制炎性因子表達(dá)減輕損傷，從而使谷氨酸水平下降；反之，高濃度谷氨酸時激活A(yù)2A受體，則可能主要通過促進(jìn)谷氨酸及炎性因子釋放而加重?fù)p傷。 2、在無谷氨酸及較低濃度(0.1mmol/L)谷氨酸條件下，激

7、活A(yù)2A受體可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NOS活性，并伴隨著cAMP的上調(diào)。這種效應(yīng)可以被PKA抑制劑H-89所阻斷。而在較高濃度(0.5mmol/L及5.0mmol/L)的谷氨酸條件下，A2A受體活化則顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NOS活性，但與LPS組比較，并不伴隨cAMP的改變。這種效應(yīng)可被PKC抑制劑GF109203X而非PKA抑制劑H-89所拮抗。這表明A2A受體活化后，在無谷氨酸及低濃度谷氨酸條件下，可能主要通過PK

8、A途徑發(fā)揮作用；而在高濃度谷氨酸條件下，則主要通過PKC途徑發(fā)揮作用。此外，我們在中性粒細(xì)胞上，通過檢測LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞TNF-α表達(dá)再次證實了不同濃度谷氨酸對A2A受體活化后效應(yīng)的調(diào)控：與在小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察的結(jié)果相一致，在無谷氨酸及較低濃度(0.1mmol/L)谷氨酸條件下，激活A(yù)2A受體可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞TNF-α表達(dá)；而在較高濃度(0.5mmol/L及5.0mmol/L)的谷氨酸條件下，A2A受體活化則顯著促

9、進(jìn)LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞TNF-α表達(dá)。 進(jìn)一步通過聯(lián)合應(yīng)用谷氨酸釋放抑制劑與A2A受體激動劑的整體動物TBI實驗發(fā)現(xiàn)，在抑制谷氨酸釋放的前提下，激活A(yù)2A受體可以使其在高濃度谷氨酸條件下的促炎損傷作用又重新轉(zhuǎn)變?yōu)橐盅妆Ｗo(hù)效應(yīng)。通過上述細(xì)胞及整體動物實驗證實：谷氨酸濃度的高低確實調(diào)控著TBI后A2A受體激活后的效應(yīng)走向，高濃度的谷氨酸可以使A2A受體活化后從PKA途徑的抑炎保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)镻KC的促炎損傷效應(yīng)，即谷氨酸濃度的高低可

10、能是A2A受體產(chǎn)生雙向作用的重要原因之一。 3、在TBI模型中，選擇性敲除或重建骨髓來源細(xì)胞上的A2A受體均具有同整體A2A受體敲除一致的保護(hù)作用，雖然三者在對谷氨酸釋放抑制上作用相當(dāng)，但選擇性敲除A2A受體卻體現(xiàn)出更顯著的抑炎效應(yīng)。相反，在ALI模型中，選擇性敲除骨髓來源細(xì)胞上的A2A受體與整體A2A受體敲除卻能通過促炎作用顯著加重肺損傷，而選擇性重建骨髓來源細(xì)胞上的A2A受體卻對傷情影響不大。以上結(jié)果提示：骨髓來源細(xì)胞上的A

11、2A受體在較高濃度谷氨酸環(huán)境中主要發(fā)揮促炎損傷效應(yīng)，而在無谷氨酸存在時發(fā)揮抑炎保護(hù)作用。這與2中細(xì)胞實驗結(jié)果一致，從而證實：骨髓來源細(xì)胞上的A2A受體可能是TBI后谷氨酸調(diào)控A2A受體的主要靶標(biāo)，而其受谷氨酸濃度調(diào)控而產(chǎn)生的不同生物學(xué)效應(yīng)可能是A2A受體在TBI及其它中樞損傷中產(chǎn)生雙向作用的重要細(xì)胞機(jī)制。 上述研究結(jié)果表明：A2A受體活化在顱腦創(chuàng)傷模型中同樣存在雙向作用：高濃度的谷氨酸可以使A2A受體活化后從抑炎保護(hù)效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇?/p>