K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用及褪黑素神經(jīng)保護機制的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科的常見病、多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點，是急需解決的臨床問題。興奮性氨基酸的過度釋放被認為是TBI后繼發(fā)性損傷機制的起始因素，其神經(jīng)毒性作用對患者的預后產(chǎn)生重要的影響。KCC2作為成熟神經(jīng)元細胞氯離子濃度梯度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腦內(nèi)GABA介導的內(nèi)源性抑制性神經(jīng)傳遞作用中發(fā)揮重要作用。然而，到目前為止，有關(guān)KCC2在

2、TBI中的抗興奮毒性損傷作用及其病理生理意義研究甚少。另一方面，褪黑素(melatonin，Mel)作為是一種由松果體合成與分泌的吲哚胺類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有抗炎和抗氧化等多種神經(jīng)保護作用。在TBI模型中，Mel能夠減少TBI后腦組織細胞死亡，但其具體的分子作用機制尚未明確。
　　本研究擬通過研究KCC2在TBI后皮層腦組織中動態(tài)表達及分布情況，探討KCC2的表達水平與TBI的相互關(guān)系，以期為TBI的治療提供一個新靶點。其次，本課

3、題試圖驗證褪黑素對TBI大鼠具有腦保護作用，并探索該作用是否與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)/KCC2信號通路的激活及神經(jīng)元凋亡被抑制相關(guān)，為探索抑制TBI后神經(jīng)元凋亡開拓新的研究思路。
　　研究方法：
　　根據(jù)不同的實驗內(nèi)容，該研究分兩部分:

4、>　　(1)該實驗擬研究KCC2在TBI后皮層腦組織中動態(tài)表達及分布情況，探討KCC2的表達水平與TBI的相互關(guān)系。采用定量腦皮質(zhì)挫傷方法建立TBI模型后，檢測大鼠損傷側(cè)皮層腦組織中KCC2蛋白表達水平在TBI后0h，3h，6h，12h，24h，72h及168h的表達狀況。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測KCC2 mRNA在TBI后168h內(nèi)損傷側(cè)皮層腦組織中表達水平隨時間的變化趨勢。采用免疫熒光技術(shù)觀察KCC2與神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞共定位的情況

5、。
　　(2)該實驗擬探討大鼠TBI后褪黑素治療在神經(jīng)元凋亡中的作用，并探討該作用是否與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)/KCC2信號通路激活及神經(jīng)元凋亡被抑制相關(guān)。雄性SD大鼠隨機分成以下3組:sham+vehicle組;TBI+vehicle組;TBI+

6、褪黑素組。于TBI建模成功后5min，1h，2h，3h，4h腹腔給予褪黑素或相應等體積的vehicle（生理鹽水+95％乙醇）。手術(shù)后24 h取假手術(shù)組、損傷組和治療組損傷中心區(qū)皮層組織行FJB染色(Fluoro-Jade B staining)檢測神經(jīng)元變性壞死水平;對損傷側(cè)皮層BDNF、ERK、p-ERK、KCC2和活化的caspase-3表達水平進行檢測;用TUNEL染色與NeuN共染評估神經(jīng)元凋亡狀況;采用改良的神經(jīng)功能缺損評分

7、(mNSS)評價各組大鼠手術(shù)后24h神經(jīng)功能缺損狀況;同時采用干/濕重稱量法計算各組大鼠手術(shù)后24h腦組織含水量腦組織含水量并進行統(tǒng)計分析。
　　研究結(jié)果：
　　(1)研究發(fā)現(xiàn)，TBI后損傷側(cè)皮層腦組織中的KCC2蛋白量呈降低趨勢，于12h開始出現(xiàn)顯著降低(p＜0.05)，直至傷后168h(p＜0.05)。熒光定量PCR結(jié)果顯示:與0h組相比，損傷側(cè)皮層腦組織KCC2 mRNA水平在損傷后6h開始即出現(xiàn)顯著降低(p＜0.05

8、)，持續(xù)至傷后168h(p＜0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示:KCC2與 NeuN，而非GFAP共染;此外，KCC2表達于細胞膜而非定位于細胞核中。
　　(2)與sham+vehicle組比較，TBI后大腦皮層BDNF、p-ERK和KCC2的表達明顯降低，而激活態(tài)的caspase-3表達水平明顯增加，同時神經(jīng)元凋亡、腦水腫及神經(jīng)功能缺損明顯加重(P＜0.05);與TBI+vehicle組比較，褪黑素干預后大腦皮層BDNF、p-ERK和

9、KCC2的表達明顯升高，神經(jīng)元凋亡減少，腦水腫減輕，同時神經(jīng)功能得到改善(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　TBI后損傷側(cè)皮層腦組織中神經(jīng)元特異的KCC2蛋白及mRNA表達水平持續(xù)降低，提示其可能參與了TBI后繼發(fā)性損傷的病理過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，KCC2表達下調(diào)可能促進了TBI后神經(jīng)元凋亡。Mel能促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)的表達及細胞外調(diào)節(jié)蛋