Nrf2-ARE通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用及萊菔硫烷神經(jīng)保護機制的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)專指一類由外傷導(dǎo)致腦組織嚴重損害的疾病,具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點,目前已成為影響人類健康的首要原因。近期調(diào)查數(shù)據(jù)顯示:全球每年TBI發(fā)病率為200／100,000,死亡率為20／100,000。且幸存者均遺留有不同程度的神經(jīng)和心理方面的功能障礙,給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟和精神負擔。TBI治療手段有限,到目前為止,尚無一種藥物被證

2、實具有確切的臨床療效。因此,如何深入研究其病理生理機制以及尋找合適的治療靶點一直是TBI研究的熱點和難點。
　　 對TBI病理機制研究發(fā)現(xiàn),TBI后神經(jīng)元損傷機制包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。其中原發(fā)性損傷發(fā)生在損傷當時,為臨床不可干預(yù)因素；而繼發(fā)性損傷發(fā)生于損傷后數(shù)分鐘到數(shù)天內(nèi),它是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的病理改變,是造成腦損傷發(fā)生、發(fā)展的重要原因。因此,對繼發(fā)性腦損傷的治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。繼發(fā)性腦損傷的病理機制

3、十分復(fù)雜,其機制主要包括興奮性氨基酸毒性、氧自由基損傷、炎癥反應(yīng)及鈣離子超載等。目前認為,腦損傷后缺血造成的神經(jīng)元損傷類似于腦缺血再灌注損傷,是多種致病機制共同作用相互促進的結(jié)果,其中氧自由基連鎖反應(yīng)是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)。大量研究證實,腦損傷后,大量的氧自由基產(chǎn)生,一方面直接使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷破壞細胞膜及其他細胞結(jié)構(gòu)；另一方面通過刺激細胞因子和黏附分子的表達,介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng),導(dǎo)致及加重腦組織損傷；除

4、此之外,氧自由基還能通過抑制線粒體功能等間接的途徑激活凋亡信號通路,引起細胞凋亡。這些環(huán)節(jié)共同發(fā)展,惡性循環(huán),最終導(dǎo)致神經(jīng)元缺血壞死。因此,針對氧自由基在繼發(fā)性腦損傷病理機制中扮演的重要反面角色,抑制氧化應(yīng)激和清除氧自由基可能是治療TBI的重要策略。然而,另人遺憾的是,盡管許多抗氧化劑在動物實驗中證實有效,但臨床試驗卻未見明確療效。鑒于氧化應(yīng)激引起損傷具有多途徑作用機制的特點,且許多外源性抗氧化劑又存在諸多的缺陷:例如,不能透過血腦屏障

5、、在體內(nèi)不穩(wěn)定、治療時間窗狹窄、高劑量時具有毒副作用等。因此,尋找一具有多途徑抗氧化損傷特點的內(nèi)源性抗氧化通路可能為臨床治療TBI提供新的方向和策略。
　　 目前研究認為,機體在產(chǎn)生氧化應(yīng)激的同時,體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)也被激活,從而抑制氧化應(yīng)激造成的損傷,使機體處于平衡狀態(tài)。Nrf2-ARE通路是體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中至關(guān)重要的一條通路。人體內(nèi)多種抗氧化酶、解毒酶、鈣離子穩(wěn)態(tài)蛋白等都含有一個共同的啟動子序列——抗氧化反應(yīng)元件(a

6、ntioxidant responseelement,ARE)；與ARE結(jié)合的多種轉(zhuǎn)錄因子中,轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid2-related factor2,Nrf2)目前被認為是起關(guān)鍵作用且可被外界因素所誘導(dǎo)的。Nrf2屬于轉(zhuǎn)錄因子CNC堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族。在生理狀態(tài)下,Nrf2主要集中于細胞漿內(nèi),與細胞質(zhì)接頭蛋白Keap1結(jié)合形成復(fù)合體。Keap1是Nrf2負性調(diào)控因子,它可介導(dǎo)

7、Nrf2泛素化被蛋白酶體降解,從而保持Nrf2的低活性生理狀態(tài)。當發(fā)生氧化應(yīng)激或受到其它化學物質(zhì)刺激時,Nrf2通過磷酸化與Keap1解耦連,進入細胞核,與相關(guān)基因的ARE序列結(jié)合,進而誘導(dǎo)其調(diào)控的靶基因表達血紅素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinine oxidoreductase1,NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase

8、,GSH-Px)等抗氧化和解毒酶,從而保護機體免受活性物質(zhì)(如氧自由基)及一些毒性物質(zhì)(如致癌物、藥物代謝活性產(chǎn)物等)的侵害。
　　 最近,Nrf2-ARE通路在多個臟器中被證實可發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用來拮抗氧化應(yīng)激損傷。體外實驗證實,激活Nrf2-ARE通路可以保護心肌細胞避免氧自由基所致的細胞損害。Nrf2還可通過增加解毒和抗氧化能力保護肺臟抵御香煙誘導(dǎo)的肺損傷、高氧損傷和博來霉素介導(dǎo)的肺纖維化。同時,Nrf2在抵御肝缺血再灌

9、注損傷、肝纖維化、膽結(jié)石、藥物性肝損傷以及炎癥性腸疾病所致的氧化應(yīng)激中也起重要作用。另外,Nrf2／ARE通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益得到重視。
　　 研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后小鼠腦組織內(nèi)Nrf2表達增加,而激活Nrf2／ARE通路則增加腦組織內(nèi)谷胱甘肽含量,減輕缺血性腦損傷。此外,Nrf2／ARE通路對腦出血亦有一定的保護作用,其機制是抑制炎癥反應(yīng),減少細胞凋亡。但是到目前為止,有關(guān)Nrf2／ARE通路在TBI中的抗氧化作用及其機制

10、還研究甚少。
　　 萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是一種異硫氰酸鹽,主要來源于綠花椰菜一類的十字花科蔬菜,具有抗氧化、抗腫瘤等生物學特性,作為化學預(yù)防藥物已引起廣大研究者的關(guān)注。體外實驗已證實該化合物是Nrf2重要的激活劑,能夠誘發(fā)Nrf2活化轉(zhuǎn)位入核,與ARE結(jié)合,正向調(diào)控Ⅱ相解毒酶的表達,清除自由基。但SFN對TBI后神經(jīng)元的保護作用及其具體分子機制尚未清楚。
　　 本研究擬采用大鼠和Nrf2基因敲除小

11、鼠,通過建立經(jīng)典TBI模型,探討Nrf2／ARE通路在TBI后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷中的作用及調(diào)控機制,同時進一步驗證以該通路為靶點的藥物SFN對TBI的神經(jīng)保護作用,以期為臨床治療TBI提供新的思路,同時也為SFN臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 第一部分 Nrf2-ARE信號通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的表達及意義。
　　 目的:
　　 研究Nrf2-ARE信號通路在創(chuàng)傷性腦損傷后動態(tài)表達和分布情況,探討Nrf2-A

12、RE通路和創(chuàng)傷性腦損傷的相互關(guān)系,以期為創(chuàng)傷性腦損傷的治療提供一新的治療靶點。
　　 方法:
　　 1、實驗?zāi)Ｐ徒⒑头纸M:選擇健康成年雄性大鼠112只,體重為250-300g,自由飲食條件下飼養(yǎng)(浙江省醫(yī)學科學院動物中心提供)。采用定量腦皮質(zhì)挫傷方法制作創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型。將動物按損傷不同時間點分為7組,分別為假手術(shù)組、傷后1小時組、傷后6小時組、傷后12小時組、傷后24小時組、傷后48小時組、傷后72小時組,

13、各組動物均為16只。
　　 2、TBI后Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1蛋白表達:按不同時間點分別提取大鼠損傷側(cè)皮層組織,采用western blot方法檢測Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1蛋白動態(tài)表達。
　　 3、TBI后Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1 mRNA表達:按不同時間點分別提取大鼠損傷側(cè)皮層組織,采用RT-PCR檢測損傷皮層Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1 mRA動態(tài)表達。
　

14、　 4、組織病理學觀察:采用免疫熒光技術(shù)觀察Nrf2在TBI后損傷側(cè)皮層中不同細胞表達和分布情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、TBI組術(shù)后各時間點Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白水平均高于假手術(shù)組(P<0.01)；TBI組術(shù)后各時間點相比,1 h表達即開始升高,24 h達高峰,48 h及72 h有所回落,但與假手術(shù)組相比仍較高(P<0.01)。
　　 2、RT-PCR結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,TBI后各組Nrf

15、2 mRNA水平無明顯變化(P>0.05)；HO-1、NQO1 mRNA水平在損傷后1 h開始升高,24 h達高峰,然后持續(xù)回落,但仍高于假手術(shù)組(P<0.01)。
　　 3、免疫熒光結(jié)果顯示:假手術(shù)組中,Nrf2在正常腦組織中有少量表達,共聚焦結(jié)果顯示,其主要位于在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞漿中；損傷后,Nrf2在損傷側(cè)皮質(zhì)中表達明顯升高,共聚焦結(jié)果顯示,Nrf2主要位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞核和胞漿中。
　　 結(jié)論:

16、　　 1、Nrf2在TBI早期即可被激活,其調(diào)控并非發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平,而是轉(zhuǎn)錄后水平。
　　 2、TBI后Nrf2表達主要位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞核和胞漿中,且其激活的區(qū)域與腦外傷后損傷區(qū)域相一致。
　　 3、TBI后Nrf2的激活上調(diào)了其下游的抗氧化和解毒酶水平,提示Nrf2-ARE通路可能參與了TBI后內(nèi)源性應(yīng)激防御機制。
　　 第二部分 Nrf2-ARE通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的保護作用及其調(diào)控機制。
　

17、　 目的:
　　 本研究通過采用Nrf2基因敲除小鼠建立腦損傷模型,觀察Nrf2-ARE通路對腦損傷后神經(jīng)功能缺損、腦水腫、腦損傷體積、神經(jīng)元損傷、氧自由基以及相關(guān)抗氧化酶變化的影響,探討Nrf2-ARE通路在創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷中的作用及其具體分子機制,為臨床治療TBI提供新的靶點和思路。
　　 方法:
　　 1、實驗分組和動物模型:采用基因敲除小鼠,運用定量腦皮質(zhì)挫傷方法制作創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型

18、。實驗動物分四組:(Nrf2+／+)假手術(shù)組、(Nrf2+／+)腦損傷組、(Nrf2-／-)假手術(shù)組、(Nrf2-／-)腦損傷組。
　　 2、神經(jīng)功能評分:采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)評價四組實驗動物TBI后7天后神經(jīng)功能缺損狀況。mNSS評分包括肢體運動、感覺、反射及平衡和協(xié)調(diào)性四項,評分范圍0—18分,分數(shù)越高表明大鼠的神經(jīng)功能缺損越重。
　　 3、腦含水量測定:通過干濕重稱量法計算四組實驗動物損傷24 h

19、后腦組織含水量。
　　 4、腦損傷體積測定:參照鼠腦立體定位圖譜,選取Bregma1到-3.25 mm腦片斷面。每隔500μm取一張20μm腦片,貼于明膠包被的載玻片上,室溫晾干后37℃烘干。梯度乙醇常規(guī)脫水,在1％甲苯胺藍液中染色2～3 min,常規(guī)脫水脫脂,中性樹脂封片。經(jīng)視體顯微鏡拍照后經(jīng)Imagepro軟件圖像分析,確定腦損傷體積。
　　 5、神經(jīng)元變性壞死檢測:取假手術(shù)組及損傷組損傷中心區(qū)皮層組織,FJB染色(

20、Fluoro-Jade B staining)檢測神經(jīng)元交性壞死水平。
　　 6、氧化應(yīng)激損傷檢測:取假手術(shù)組及損傷組損傷中心區(qū)皮層組織,采用ELISA法檢測氧化應(yīng)激指標:采用蛋白羰基(Protein Carbonyls)試劑盒檢測蛋白質(zhì)氧化損傷程度；采用4-羥基壬烯酸(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)試劑盒檢測脂質(zhì)過氧化程度；采用8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-

21、OHdG)檢測DNA氧化損傷程度。
　　 7、Nrf2-ARE通路下游抗氧化和解毒酶HO-1、NQO1的表達:取假手術(shù)組及損傷組損傷中心區(qū)皮層組織,采用western blot和RT-PCR方法檢測HO-1、NQO1的蛋白和mRNA含量。
　　 結(jié)果:
　　 1、假手術(shù)組中,Nrf2+／+卅小鼠與Nrf2-／-小鼠相比,神經(jīng)功能評分無顯著差異(P>0.05)；腦損傷后,Nrf2+／+小鼠與Nrf2-／-。小鼠均表

22、現(xiàn)出明顯神經(jīng)功能缺損,且Nrf2-／-小鼠較Nrf2+／+小鼠表現(xiàn)為更為嚴重,兩組有顯著性差異(P<0.01)。
　　 2、假手術(shù)組中,Nrf2+／+小鼠與Nrf2-／-小鼠無明顯腦水腫；腦損傷后Nrf2+／+小鼠與Nrf2-／-小鼠均出現(xiàn)明顯腦水腫,且Nrf2-／-小鼠較Nrf2+／+小鼠腦水腫表現(xiàn)更為嚴重,兩組有顯著性差異(P<0.01)。
　　 3、腦損傷后,Nrf2+／+小鼠與Nrf2-／-小鼠的損傷側(cè)的腦半球出

23、現(xiàn)明顯的損傷灶,與其相對應(yīng)的假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.01),但Nrf2-／-小鼠的損傷體積較Nrf2+／+小鼠的損傷體積更大,兩組有顯著性差異(P<0.01)。
　　 4、腦損傷后,Nrf2+／+小鼠與Nrf2-／-小鼠的損傷側(cè)腦皮層神經(jīng)元明顯變性壞死,與其相對應(yīng)的假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.01),但Nrf2-／-小鼠的神經(jīng)元變性壞死較Nrf2+／+小鼠更為明顯,兩組有顯著性差異(P<0.01)。
　　

24、 5、氧化應(yīng)激損傷指標:蛋白羰基、4-HNE和8-OHdG在Nrf2+／+與Nrf2-／-兩組假手術(shù)組中只有少量表達,且兩組之間無顯著性差異(P>0.05)；腦損傷后氧化應(yīng)激指標在Nrf2+／+與Nrf2-／-兩組小鼠表現(xiàn)為明顯上調(diào),但Nrf2-／組較Nrf2+／+組更為明顯,兩組有顯著性差異(P<0.01)。
　　 6、假手術(shù)組中,與Nrf2+／+小鼠相比,Nrf2-／-小鼠組HO-1、NQO1 mRNA和蛋白水平明顯降低(P

25、<0.01)；腦損傷后,Nrf2+／+組HO-1、NQO1 mRNA和蛋白水平較其對應(yīng)的假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.01),但在Nrf2-／-小鼠組HO-1、NQO1 mRNA和蛋白水平較其對應(yīng)的假手術(shù)組無明顯變化(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、Nrf2-ARE通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　 2、Nrf2-ARE通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的保護作用可能是通過上調(diào)抗氧化／解毒酶表達從而抑制氧化應(yīng)

26、激損傷來實現(xiàn)。
　　 3、Nrf2-ARE通路可能成為是創(chuàng)傷性腦損傷藥物治療的新靶點。
　　 第三部分萊菔硫烷對創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護作用及機制探討。
　　 目的:
　　 通過研究萊菔硫烷對創(chuàng)傷性腦損傷后Nrf2-ARE通路的表達調(diào)控和對氧化應(yīng)激損傷的影響,探討萊菔硫烷對創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護作用及其具體分子調(diào)控機制,以期為臨床治療TBI提供新的策略,同時也為SFN臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

27、　　 方法:
　　 1、實驗動物模型和分組:采用健康SD大鼠和基因敲除小鼠,運用定量腦皮質(zhì)挫傷方法制作創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型。實驗動物分組:大鼠分為三組:假手術(shù)組、損傷組、SFN治療組；小鼠分為四組:Nrf2+／+損傷組、Nrf2-／-損傷組、Nrf2+／+治療組、Nrf2-／-治療組。治療組動物在損傷后15 mim給予SFN腹腔注射5mg／kg劑量。
　　 2、神經(jīng)功能評分:采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)

28、評價實驗動物TBI后7天內(nèi)神經(jīng)功能缺損狀況。mNSS評分包括肢體運動、感覺、反射及平衡和協(xié)調(diào)性四項,評分范圍0～18分。
　　 3、腦含水量測定:通過干濕重稱量法計算各組實驗動物損傷24 h后腦組織含水量。
　　 4、腦損傷體積測定:參照鼠腦立體定位圖譜,選取Bregma1.60到-4.80 mm腦片斷面。每隔500μm取一張20μm腦片,貼于明膠包被的載玻片上,室溫晾干后37℃烘干。梯度乙醇常規(guī)脫水,在0.25％CV液

29、中染色2～3 min,常規(guī)脫水脫脂,中性樹脂封片。經(jīng)Imagepro圖像分析軟件,確定腦損傷體積。
　　 5、神經(jīng)元變性壞死檢測:取各組實驗動物損傷中心區(qū)皮層組織,FJB染色(Fluoro-Jade B staining)檢測神經(jīng)元變性壞死水平。
　　 6、氧化應(yīng)激損傷檢測:取各組實驗動物損傷中心區(qū)皮層組織,采用ELISA法檢測氧化應(yīng)激指標:采用蛋白羰基(Protein Carbonyls)試劑盒檢測蛋白質(zhì)氧化損傷程度；

30、采用4-羥基壬烯酸(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)試劑盒檢測脂質(zhì)過氧化程度；采用8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)檢測DNA氧化損傷程度。
　　 7、Nrf2蛋白的表達和定位:在大鼠動物模型中完成。取三組大鼠模型組損傷中心區(qū)皮層組織采用western blot檢測Nrf2核蛋白的表達；同時免疫熒光共聚集方法對Nrf2進行細胞定位。
　　 8、Nr

31、f2-ARE通路下游抗氧化和解毒酶HO-1、NQO1的表達:在大鼠動物模型中完成。取各組實驗動物損傷中心區(qū)皮層組織,采用western blot和RT-PCR方法檢測HO-1、NQO1的蛋白和mRNA含量。
　　 結(jié)果:
　　 1、與假手術(shù)組相比,TBI后大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損、腦水腫以及腦形態(tài)學改變(腦皮層組織的缺損),兩組間有顯著性差異(P<0.01)；而SFN治療能明顯改善大鼠神經(jīng)功能評分、減輕腦水腫以及減少

32、損傷側(cè)腦組織損傷體積,兩組間有顯著性差異(P<0.01)。
　　 2、TBI后,損傷側(cè)皮層FJB陽性神經(jīng)元明顯增多,提示神經(jīng)元出現(xiàn)明顯變性壞死,而SFN治療能明顯減少損傷灶周圍的變性神經(jīng)元數(shù)目。
　　 3、與假手術(shù)組相比,TBI組蛋白羰基、4-HNE和8-OHdG含量明顯增多,提示TBI導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)明顯氧化應(yīng)激損傷；而SFN治療能明顯減少損傷灶周圍氧化應(yīng)激損傷。
　　 4、假手術(shù)組大鼠腦組織中Nrf2核蛋白含量

33、較低。TBI后損傷側(cè)腦組織中Nrf2核蛋白表達增強；而SFN治療也能明顯上調(diào)Nrf2核蛋白表達且較損傷組更明顯。免疫熒光結(jié)果顯示:假手術(shù)組大鼠腦組織中神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞有少量的Nrf2表達且主要位于胞漿,TBI后神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)Nrf2增加明顯且主要位于胞漿和胞核,而SFN治療后神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)Nrf2表達較損傷組更明顯且主要位于胞核。
　　 5、假手術(shù)組大鼠腦組織中HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平較低。腦損傷組和SFN治

34、療組中HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平明顯上調(diào),但SFN治療組較損傷組更明顯。
　　 6、在Nrf2基因敲除小鼠中,Nrf2-／-損傷組小鼠較Nrf2+／+損傷組小鼠表現(xiàn)出更為明顯的神經(jīng)功能缺失、腦水腫及氧化應(yīng)激損傷；SFN治療可明顯減輕TBI后Nrf2+／+組小鼠上述繼發(fā)性損傷,但對TBI后Nrf2-／-組小鼠卻無作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、SFN能減輕TBI后繼發(fā)性損傷,對TBI有神經(jīng)保護作用。

35、>　　 2、這種神經(jīng)保護作用是通過激活Nrf2-ARE通路誘導(dǎo)下游抗氧化／解毒酶等靶基
　　 因的表達從而抑制氧化應(yīng)激損傷來實現(xiàn)。
　　 3、以Nrf2-ARE通路的藥物治療對臨床TBI的防治具有良好的應(yīng)用前景。
　　 綜上所述,Nrf2-ARE通路是機體一條重要的內(nèi)源性抗氧化通路.其在TBI后早期即被激活,可抑制TBI后氧化應(yīng)激損傷,對TBI發(fā)揮神經(jīng)保護作用。針對Nrf2-ARE通路為靶點的藥物治療將為TBI