腺苷受體A1和A2A相互作用對(duì)缺血性腦損傷的影響.pdf

1、背景：隨著人口的不斷老齡化，腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素如糖尿病逐年增加，缺血性腦血管病的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，且致殘率高，給每一個(gè)家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和心里負(fù)擔(dān)。盡管各國(guó)的神經(jīng)科學(xué)界投入大量精力進(jìn)行該類疾病的相關(guān)研究，但就缺血性腦血管病的神經(jīng)保護(hù)方面，至今尚無確切有效的方法真正通過臨床試驗(yàn)成為能讓腦梗死患者獲益的治療手段，這其中就包括氧自由基清除劑、鈣離子拮抗劑、谷氨酸受體抑制劑等。因此我們?cè)谔剿餍碌娜毖毖跣阅X損傷的神經(jīng)保護(hù)治療途徑顯得

2、非常必要，也非常緊迫。
　　 腺苷(Adenosine，ADO)作為一種神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟、胃腸道等組織，調(diào)節(jié)著各種重要的生理功能。ADO通過與其特異的受體A1R、A2AR、A2BR和A3R結(jié)合，參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程。在ADO的四種受體中，A1R和A2AR在腦內(nèi)的分布及數(shù)量明顯多于另外兩種受體，且與ADO的親和力也更強(qiáng)。既往的研究發(fā)現(xiàn)，ADO作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其神經(jīng)保護(hù)功能

3、是通過激活其抑制性受體A1產(chǎn)生的，并證明A1受體激活產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制了谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性有關(guān)[1-3]。在正常情況下，ADO生理濃度僅為40nmol/L-400nmol/L；研究發(fā)現(xiàn)在腦供血不足和缺氧性等損傷后腦內(nèi)細(xì)胞突觸間隙外液中腺苷水平明顯升高(達(dá)正常時(shí)200倍以上)，并作用于受體發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，與此同時(shí)以谷氨酸為代表的興奮性氨基酸的濃度也急劇升高，并啟動(dòng)了腦缺血后一系列病理生理過程最終導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的壞死或凋亡[3-4

4、]。而在本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腺苷A2A受體基因敲除后能顯著減少腦缺血/再灌注區(qū)細(xì)胞外的谷氨酸濃度，并改善神經(jīng)功能，減少腦梗死體積[5]，但確切機(jī)制尚未闡明?？梢钥闯?，在腦缺血狀態(tài)下急劇增加的ADO并沒能通過激活A(yù)1受體起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。反之，在腦缺血/再灌注后A2AR激活并抑制A1R可能是導(dǎo)致腦缺血損傷的重要原因。因此我們假設(shè)，A2AR與A1R間存在相互拮抗作用，在腦局灶缺血條件下，腺苷A2A受體表達(dá)增加并抑制了A1R的功能

5、，當(dāng)阻斷A2AR后產(chǎn)生的缺血性神經(jīng)保護(hù)作用，與其激活或保護(hù)了A1受體功能有關(guān)，并抑制了谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。既往研究還發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸。在谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體各亞型中，GLT-1主要分布于紋狀體區(qū)等前腦的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，承擔(dān)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞間隙中谷氨酸的主要任務(wù)。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠MCAO模型使用腺苷A2A受體抑制劑(SCH58261)所起到的神經(jīng)保護(hù)作用與缺血區(qū)GLT-1增加有關(guān)，減輕神經(jīng)元的損傷及

6、興奮性遞質(zhì)的傳遞[6]。由此，本課題計(jì)劃從影響GLT-1及腺苷A1表達(dá)的角度深入探討A1-A2A受體相互作用對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的谷氨酸釋放增加調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)以腺苷A2A受體基因敲除小鼠大腦中動(dòng)脈缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)模型作為研究對(duì)象，觀察A2AR基因敲除對(duì)A1R表達(dá)的影響；從整體水平觀察激活或抑制A1R功能對(duì)A2AR缺失后神經(jīng)保護(hù)作用的影響，并觀察缺血/再灌注區(qū)GLT-1表達(dá)的變化，試圖揭示腺苷受體

7、的缺血性神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制，為開拓缺血性神經(jīng)保護(hù)治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 以腺苷A2AR基因敲除小鼠作用研究對(duì)象。采用PCR擴(kuò)增方法鑒定小鼠基因型，并篩選出實(shí)驗(yàn)所需的腺苷受體A2A基因敲除小鼠(A2AR/KO)與同窩野生型小鼠(A2AR/WT)制備成MCAo模型，采用免疫熒光法及Western-blot方法檢測(cè)缺血/再灌注區(qū)(紋狀體區(qū))A1R表達(dá)變化；制備MCAo前檢測(cè)各組小鼠正常，分別給予腺苷A1

8、受體拮抗劑DPCPX及激動(dòng)劑CPA處理各組小鼠，觀察缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后每組小鼠神經(jīng)功能缺損程度及腦梗死體積的變化、采用免疫印記法、Western-blot方法檢測(cè)各組小鼠在MCAo缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后各組小鼠缺血/再灌注區(qū)(紋狀體區(qū))GLT-1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.缺血/再灌注后，腺苷A2A受體缺失增加了A1受體的表達(dá)
　　 (1)Western Blot：腺苷A2A受體基因敲除

9、小鼠(A2AR/KO)與野生型小鼠(A2AR/WT)分別制作成MCAo缺血2小時(shí)與缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)模型，假手術(shù)組KO小鼠與WT小鼠紋狀體區(qū)A1表達(dá)無明顯差異；在缺血2小時(shí)以后A2AR/WT與A2AR/KO組比較，A1的表達(dá)未見明顯差異；缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后，WT組小鼠A1表達(dá)下降，而KO組小鼠A1表達(dá)明顯升高。
　　 (2)免疫熒光：腺苷A2A受體基因敲除小鼠(A2AR/KO)與野生型小鼠(A2AR/WT)制作

10、成大腦中動(dòng)脈缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)模型，假手術(shù)組KO小鼠與WT小鼠紋狀體區(qū)A1R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量無明顯差異；在缺血2小時(shí)后，WT小鼠紋狀體區(qū)A1R陽(yáng)性細(xì)胞有所減少，而KO小鼠A1R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少不明顯；在缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)以后WT小鼠紋狀體區(qū)A1R陽(yáng)性細(xì)胞明顯下降，而KO小鼠A1R陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，該結(jié)果與WB結(jié)果基本一致。
　　 2.阻斷A1受體后，由A2AR基因敲除產(chǎn)生的腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用被削弱，而激活A(yù)

11、1R后，這種保護(hù)作用增強(qiáng)
　　 (1)神經(jīng)功能缺損評(píng)分：缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后，無干預(yù)組、A1拮抗劑組與A1激動(dòng)劑組的KO小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯低于同組的WT組小鼠(P<0.05，P<0.01)；在使用了A1R拮抗劑以后，無論KO小鼠還是WT小鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加，明顯高于無藥物干預(yù)組(P<0.05，P<0.01)；A1R激動(dòng)劑組，無論KO小鼠還是WT小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均降低，明顯低于無藥物干預(yù)組(P<0.05，P<0.01)

12、。
　　 (2)腦梗死體積測(cè)算：缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后，無干預(yù)組、A1拮抗劑組與A1激動(dòng)劑組的KO小鼠梗死體積均明顯低于同組的WT組小鼠(P<0.01)；當(dāng)使用A1受體拮抗劑以后，無論KO小鼠還是WT小鼠，其腦梗死體積均明顯大于非干預(yù)組，(P<0.01)；當(dāng)使用A1受體激動(dòng)劑以后，無論KO小鼠還是WT小鼠，其腦梗死體積均明顯小于非干預(yù)組，(P<0.01)。
　　 3.在不同A1活性狀態(tài)下，A2AR基因敲除對(duì)腦缺血后

13、GLT-1表達(dá)量的影響
　　 (1)Western Blot法檢測(cè)GLT-1的表達(dá)：假手術(shù)組，WT與KO小鼠紋狀體區(qū)GLT-1表達(dá)無明顯差異。缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后WT小鼠GLT-1表達(dá)較缺血前減少，而KO小鼠其GLT-1表達(dá)無明顯減少，表達(dá)量明顯多于WT小鼠；在使用A1拮抗劑后，KO小鼠的GLT-1表達(dá)下降，明顯低于非藥物干預(yù)組；而使用A1激動(dòng)劑后KO小鼠紋狀體區(qū)GLT-1表達(dá)增加，在WT組，各干預(yù)組GLT-1表達(dá)差異不

14、明顯。
　　 (2)免疫熒光法檢測(cè)GLT-1的表達(dá)：缺血前WT與KO小鼠GLT-1的表達(dá)無明顯差異，在缺血2小時(shí)/再灌注22小時(shí)后無藥物干預(yù)組WT與KO小鼠紋狀體區(qū)GLT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組有所減少，WT小鼠這種減少程度更為明顯；使用A1R拮抗劑以后，WT組小鼠與KO小鼠紋狀體區(qū)GLT-1陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于非藥物干預(yù)組；在使用A1R激動(dòng)劑以后，KO組小鼠GLT-1陽(yáng)性細(xì)胞較非藥物干預(yù)組及A1R拮抗劑組明顯增多。
　　

15、 結(jié)論：
　　 1.在缺血/再灌注損傷條件下，腺苷A2A受體缺失能增強(qiáng)腺苷A1的表達(dá)，其激活或保護(hù)了A1受體功能。
　　 2.當(dāng)阻斷腺苷受體A1后，由腺苷A2AR缺失產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用被削弱，激活腺苷受體A1后由腺苷A2A受體缺失產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用被增強(qiáng)。因此我們推測(cè)：由阻斷腺苷A2AR產(chǎn)生的缺血性神經(jīng)保護(hù)作用與A1R表達(dá)增加及功能激活有關(guān)。當(dāng)阻斷腺苷A2A受體并同時(shí)激活A(yù)1受體以后可協(xié)同增強(qiáng)這種缺血性神經(jīng)保護(hù)作用。

16、r>　　 3.腺苷A2AR缺失能增強(qiáng)缺血/再灌注區(qū)GLT-1的表達(dá)，當(dāng)阻斷腺苷受體A1功能時(shí)，這種表達(dá)增強(qiáng)的趨勢(shì)被削弱；當(dāng)激活腺苷受體A1功能時(shí)，這種表達(dá)增強(qiáng)的趨勢(shì)被強(qiáng)化。結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：腺苷A2A受體基因敲除后能顯著減少腦缺血/再灌注區(qū)細(xì)胞外的谷氨酸濃度，并改善神經(jīng)功能，由此我們推測(cè)：腺苷A2A受體缺失產(chǎn)生的缺血性神經(jīng)保護(hù)功能可能與激活A(yù)1R功能并上調(diào)GLT-1表達(dá)，增加了向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸能力，從而減輕了由大量谷氨酸堆積