去分化間充質(zhì)干細(xì)胞再成骨分化潛能研究.pdf

1、第一部分：去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)及生物學(xué)特性
　　目的：誘導(dǎo)去分化間充質(zhì)干細(xì)胞(De-differentiated mesenchymal stem cell, De-MSCs)，研究其生物學(xué)特性，為全面研究De-MSCs提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法:從健康成人骨髓中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell, MSCs），經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACS)表型鑒定后采用更換培養(yǎng)基方法誘導(dǎo)去分化間充質(zhì)干細(xì)胞(De

2、-MSCs)，觀察De-MSCs形態(tài)學(xué)變化，F(xiàn)ACS檢測De-MSCs細(xì)胞表型，cck8（Cell count kit，CCK）檢測比較MSCs和De-MSCs增殖效率差異。
　　結(jié)果：De-MSCs形態(tài)上回復(fù)到MSCs樣長梭形，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示De-MSCs表達(dá)MSCs某些干細(xì)胞表面標(biāo)志，cck8法檢測細(xì)胞增殖率表明De-MSCs相比MSCs有較高增殖效率。
　　結(jié)論：De-MSCs在形態(tài)和干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)上與MS

3、Cs一致，但是增殖能力更強(qiáng)，為MSCs樣細(xì)胞。
　　第二部分：去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外再成骨潛能分析
　　目的：研究人骨髓來源的去分化間充質(zhì)干細(xì)胞(De-MSCs)在體外再次成骨分化潛能和效率，探討De-MSCs潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:將MSCs和De-MSCs同時(shí)成骨誘導(dǎo)7天成為MSCs-ob和De-MSCs-ob，分別采用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測成骨相關(guān)基因，21天后采用堿性磷酸酶（ALP）活性檢測、茜素

4、紅染色法和形態(tài)學(xué)觀察檢測比較De-MSCs和MSCs成骨分化效率。
　　結(jié)果：qPCR顯示 De-MSCs成骨相關(guān)基因 BMP2,Runx2,DLX5,Osterix,Beta-c表達(dá)較MSCs明顯增強(qiáng)， ALP活性檢測與茜素紅染色顯示De-MSCs具有較強(qiáng)成骨能力。
　　結(jié)論：體外研究顯示De-MSCs再次成骨分化效率較高，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為滿足臨床和組織工程需要提供更適宜的種子細(xì)胞。
　　第三部分：去分化

5、間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)再成骨潛能分析
　　目的：去分化間充質(zhì)干細(xì)胞(De-MSCs)作為優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞是目前組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)De-MSCs體外再次成骨分化的結(jié)果，研究De-MSCs體內(nèi)再次成骨分化潛能，評(píng)估De-MSCs在骨組織工程中的潛在應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：將De-MSCs和MSCs按照相同的濃度種植在膠原模塊上，置成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)4小時(shí)后將負(fù)載細(xì)胞的移植膠原模塊入重癥聯(lián)

6、合免疫小鼠(SCID)皮下進(jìn)行體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)，分別于7天和28天進(jìn)行qPCR、堿性磷酸酶ALP活性檢測和HE組織切片，免疫組化觀察。
　　結(jié)果：qPCR檢測分析顯示De-MSCs較MSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平(BMP2,Runx2,DLX5,Osterix,Beta-c)高，且堿性磷酸酶ALP活性檢測結(jié)果顯示De-MSCs再成骨組較MSCs成骨組高（p<0.05），表明De-MSCs在體內(nèi)成骨分化的效率較MSCs高。HE組織切