電場(chǎng)加載影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究.pdf

1、電場(chǎng)刺激(Electrical Stimulation,ES)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化，應(yīng)用導(dǎo)電性材料可以增強(qiáng)局部的電流傳導(dǎo)?；诰圩笮樗?PLLA)和多壁碳納米管(MWCNTs)制備的復(fù)合材料，具有良好的生物相容性和導(dǎo)電性，可用于電場(chǎng)刺激下BMSCs成骨分化行為的研究。本論文采用靜電紡絲技術(shù)制備了平行排列的PLLA/MWCNT復(fù)合納米纖維膜，通過(guò)控制紡絲液中MWCNTs的含量，獲得了MWCNTs含量不同的、導(dǎo)

2、電性逐漸提高的材料，并以此作為細(xì)胞培養(yǎng)的基材，系統(tǒng)地研究了不同電場(chǎng)刺激方式下，對(duì)BMSCs形貌、增殖及成骨分化行為的影響。主要工作如下:
　　(1)通過(guò)酸處理得到純化的羧基化MWCNTs，以不同添加量與PLLA/三氟乙醇(TFE)溶液混合，靜電紡絲得到系列PLLA/MWCNT復(fù)合納米纖維膜，采用滾筒接收使纖維呈平行排列。經(jīng)掃描和透射電鏡觀察確定，當(dāng)MWCNTs在復(fù)合纖維中的含量不超過(guò)3wt.％時(shí)，其在纖維內(nèi)分布較均勻、無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)

3、象，且表現(xiàn)出順著纖維方向排布的趨勢(shì)。導(dǎo)電性測(cè)試結(jié)果顯示，當(dāng)MWCNTs在復(fù)合材料中的含量為3wt.％時(shí)，材料的導(dǎo)電性達(dá)到滲流閾值(1×10-2s/cm)。采用細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞形貌觀察、live/dead染色多種表征方法，證實(shí)PLLA/MWCNT復(fù)合納米纖維膜生物相容性良好、無(wú)細(xì)胞毒性，可用于BMSCs的成骨分化研究。
　　(2)建立直流電場(chǎng)(DC)用于BMSCs的體外培養(yǎng)，將BMSCs接種到上述PLLA/MWCNT復(fù)合納米

4、纖維膜上，電場(chǎng)方向設(shè)定垂直于纖維方向，改變電壓和電場(chǎng)加載時(shí)間，通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖行為的檢測(cè)，探索適宜的電場(chǎng)參數(shù)用于后續(xù)的成骨分化研究。結(jié)果顯示:無(wú)外加電場(chǎng)時(shí)，材料的導(dǎo)電性對(duì)BMSCs的增殖有一定影響，但在本論文中未檢測(cè)到顯著性差異;在有電場(chǎng)存在下，導(dǎo)電性高的材料表現(xiàn)出更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且顯著高于無(wú)外加電場(chǎng)實(shí)驗(yàn)組;確定電壓1.5V，每天對(duì)細(xì)胞加載1.5h，是較優(yōu)的電場(chǎng)培養(yǎng)條件，電壓升高或電場(chǎng)加載時(shí)間延長(zhǎng)，都會(huì)引起細(xì)胞增殖速率不同程度地

5、下降。此外發(fā)現(xiàn)，纖維排布和電場(chǎng)的加載，對(duì)BMSCs的形貌和取向也有明顯影響。
　　(3)選擇MWCNTs含量為0、1、3和5wt.％的四種PLLA/MWCNT復(fù)合納米纖維膜，在誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)的第1-7天、8-14天或15-21天，分別進(jìn)行電場(chǎng)加載，通過(guò)成骨分化相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平檢測(cè)，研究電場(chǎng)加載方式對(duì)BMSCs成骨分化的影響。結(jié)果顯示:相比于無(wú)電場(chǎng)組，所有電場(chǎng)刺激組BMSCs的成骨分化都得到了明顯促進(jìn)，而且隨著材料導(dǎo)電性的

6、提高，促進(jìn)作用更加顯著;相較于晚期的電場(chǎng)刺激（8-14天或15-21天），在誘導(dǎo)分化早期的電場(chǎng)刺激(1-7天)更能促進(jìn)成骨標(biāo)志物和基因的表達(dá)，這一點(diǎn)通過(guò)在培養(yǎng)體系中引入骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)基因表達(dá)的抑制劑noggin，并結(jié)合電場(chǎng)刺激得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　以上結(jié)果顯示，電場(chǎng)刺激和導(dǎo)電性材料的結(jié)合，是促進(jìn)BMSCs成骨分化的有效手段，尤其是早期的電場(chǎng)刺激，更能顯著促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白的分泌以及成骨基因的表達(dá)，這為將電場(chǎng)刺激應(yīng)用于促進(jìn)