石斛多糖干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂及成骨分化的研究.pdf

1、近年來，天然藥物逐漸引起了人們的重視，天然藥物作為藥物在臨床上也得到了廣泛應(yīng)用。石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥，藥效顯著，應(yīng)用歷史悠久，其具有的諸多功效已在幾千年的中醫(yī)臨床實踐中得到驗證。本論文主要研究了鐵皮石斛（Dendrobium officinale）和銅皮石斛（Dendrobium moniliforme）多糖對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂及成骨分化的影響，并嘗試通過現(xiàn)代

2、分子生物學(xué)理論來解釋石斛“滋陰補腎”的傳統(tǒng)功效，為今后更好的利用中藥石斛資源提供科學(xué)依據(jù)。
　　本實驗內(nèi)容主要包括以下4個部分：
　　1.采用常規(guī)的溶劑浸提法提取鐵皮石斛多糖和銅皮石斛多糖，并通過乙醇沉淀，Sevage法除蛋白等一系列操作對石斛多糖進行初步分離純化。所提取的鐵皮石斛多糖得率為20.4％，銅皮石斛多糖得率為10.6%。濃硫酸-苯酚比色法測得本次實驗中所提取的鐵皮石斛和銅皮石斛粗多糖中多糖含量分別為76.4%、6

3、7.5%，表明所提取的石斛多糖具有比較高的純度。
　　2.采用全骨髓貼壁篩選法分離得到SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），并進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察，并采用流式細胞儀檢測細胞表面特異性標(biāo)志物的表達情況。臺盼藍拒染法檢測細胞活力，噻唑藍（MTT）比色法測定細胞生長曲線及不同石斛多糖對BMSCs生存率的影響。結(jié)果表明：分離得到的大鼠BMSCs在顯微鏡下呈紡錘形、梭形、漩渦狀生長，形態(tài)均一，細胞活力可達95%以上

4、。流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物表達正常，基本不表達造血細胞標(biāo)志物CD45，表達CD105。細胞生存率實驗表明質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖對BMSCs的生存率無顯著影響，表明在此濃度范圍內(nèi)石斛多糖對BMSCs無細胞毒性。
　　3.誘導(dǎo)BMSCs成脂分化，添加質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖分別進行干預(yù)，干預(yù)成脂分化10天、20天后，油紅O染色并定量檢測，實時熒光定量PCR檢測過氧化

5、物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）的mRNA表達水平。實驗結(jié)果：質(zhì)量濃度為400、800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖均能顯著降低油紅O染色后的吸光值，下調(diào)PPARG、LPL、FABP4的mRNA表達。結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度下，兩種石斛多糖可顯著抑制BMSCs成脂分化。
　　4.誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，添加質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖分別進

6、行干預(yù)，干預(yù)成骨分化7天后，進行堿性磷酸酶（ALP）染色、誘導(dǎo)分化28天后，進行茜素紅染色。用實時熒光定量PCR檢測核心結(jié)合因子α1（CBFα1）、I型膠原（COL I）、骨橋蛋白（OP）的mRNA表達水平。實驗結(jié)果：成骨誘導(dǎo)后的細胞能被堿性磷酸酶及茜素紅染成紅色。鐵皮石斛多糖對成骨分化標(biāo)志基因的表達無顯著影響，而銅皮石斛多糖在質(zhì)量濃度為200μg/mL時能顯著升高成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子α1（CBFα1）和成骨分化早期標(biāo)志基