雌激素相關(guān)受體α對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用研究.pdf

1、雌激素相關(guān)受體α(estrogen related receptorα,ERRα)是最早被鑒定出來(lái)的孤兒核受體,雖然未被發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性配體,但它能通過(guò)募集輔調(diào)節(jié)因子,以組成性方式活化,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞能量代謝和生理功能中發(fā)揮重要作用,從而參與一些常見(jiàn)疾病的病理過(guò)程,例如癌癥、肥胖癥、糖尿病等。ERRα還在成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,因而成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)。然而,ERRα在骨代謝方面的現(xiàn)有研究結(jié)果尚存在不一致和未闡明之處。

2、
　　牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一種口腔臨床中易于獲得的間充質(zhì)來(lái)源的成體干細(xì)胞。它具有多向分化潛能和自我更新能力。其成骨分化能力為牙周組織再生提供了新的手段。然而,PDLSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制尚未研究透徹。ERRα是否參與調(diào)控PDLSCs成骨分化尚不清楚。針對(duì)以上問(wèn)題,本課題進(jìn)行了如下研究:
　　1. PDLSCs的培養(yǎng)鑒定及ERRα在PDLSCs中的表達(dá)

3、
　　目的:獲取原代PDLSCs,檢測(cè)ERRα在PDLSCs中的表達(dá)。方法:(1)取青少年因正畸治療需要而拔除的前磨牙,刮取根中1/3牙周膜組織,用組織塊結(jié)合酶消化法進(jìn)行牙周膜原代細(xì)胞培養(yǎng)。采用有限稀釋法進(jìn)行克隆純化并檢測(cè)克隆形成率,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖;(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志;(3)成骨、成脂誘導(dǎo),并分別進(jìn)行茜素紅S和油紅O染色檢測(cè)PDLSCs分化能力;(4)RT-PCR檢測(cè)PDLSCs中ERRαmRNA的表達(dá);

4、(5)免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光染色檢測(cè)ERRα蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)定位。結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)并進(jìn)行克隆純化的PDLSCs呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài),具有克隆形成能力和干細(xì)胞的增殖特點(diǎn);(2)PDLSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志特征,并具有成骨和成脂分化能力;(3)PDLSCs表達(dá)ERRαmRNA和蛋白,其蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有廣泛表達(dá),主要高表達(dá)于細(xì)胞核。結(jié)論:成功培養(yǎng)并鑒定了具有間充質(zhì)干細(xì)胞特征的PDLSCs,ERRα在該細(xì)胞中有廣泛表達(dá)。

5、
　　2.慢病毒介導(dǎo)的ERRα基因沉默對(duì)PDLSCs成骨分化的調(diào)控作用
　　目的:研究ERRα基因的下調(diào)對(duì)PDLSCs成骨分化的作用。方法:(1)設(shè)計(jì)針對(duì)ERRα基因的miRNA寡核苷酸序列四對(duì),通過(guò)重組克隆的方法將其插入表達(dá)載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,構(gòu)建四個(gè)miRNA表達(dá)質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)ERRα mRNA和蛋白的表達(dá),驗(yàn)證干擾效率;(2)以篩選出

6、的干擾效果最佳片段為模板構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒pLenti-miR-ERRα,進(jìn)行慢病毒包裝和純化,感染PDLSCs,構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,并使用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)PDLSCs中ERRαmRNA和蛋白的表達(dá);(3)病毒感染的PDLSCs成骨誘導(dǎo)分化后,通過(guò)ALP染色、茜素紅S染色和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、OCN、RUNX2和OPN的mRNA表達(dá),比較Lenti-miR-ERRα組與Lenti

7、-miR-neg對(duì)照組PDLSCs成骨分化能力的差異。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建4個(gè)miRNA表達(dá)質(zhì)粒,均能下調(diào)ERRαmRNA和蛋白的表達(dá),其中pcDNA6.2-miR-ERRα-4干擾效果最佳,對(duì)其進(jìn)行克隆重組、慢病毒包裝和病毒液純化;(2)成功構(gòu)建Lenti-miR-ERRα穩(wěn)轉(zhuǎn)株, ERRα的mRNA和蛋白水平受到穩(wěn)定的基因干擾,CCK-8結(jié)果顯示Lenti-miR-ERRα組PDLSCs細(xì)胞活力與轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組相比略有降低;

8、(3)Lenti-miR-ERRα組PDLSCs的ALP活性、礦化能力以及成骨相關(guān)基因ALP、OCN、RUNX2和OPN mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染對(duì)照組顯著下降。結(jié)論:(1)慢病毒miRNA載體能穩(wěn)定下調(diào)ERRα在PDLSCs中的表達(dá);(2)ERRα的下調(diào)降低了PDLSCs成骨分化能力,提示ERRα可能對(duì)PDLSCs成骨分化有促進(jìn)作用。
　　3. ERRα在PGC-1α的輔助激活下對(duì)PDLSCs成骨分化的調(diào)控作用
　　目的:研

9、究ERRα在輔激活因子PGC-1α的激活下,對(duì)PDLSCs成骨分化的影響。方法:(1)ERRα反向激動(dòng)劑XCT790作用于PDLSCs,成骨誘導(dǎo)后進(jìn)行ALP活性檢測(cè)、ALP和茜素紅S染色。(2)構(gòu)建ERRα和PGC-1α的表達(dá)載體,優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染PDLSCs條件,將兩載體分別單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染PDLSCs,實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果;(3)將PDLSCs分組為:ERRα、PGC-1α、ERRα+PGC-1α組、空轉(zhuǎn)染

10、組和空轉(zhuǎn)染+XCT790作用組;成骨培養(yǎng)7 d后,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、OCN、OPN、RUNX2和COL1A1的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:(1)XCT790顯著降低PDLSCs ERRα和PGC-1α蛋白表達(dá),并在成骨分化2周內(nèi)強(qiáng)烈抑制ALP活性,最終降低礦化PDLSCs礦化能力;(2)成功構(gòu)建ERRα和PGC-1α表達(dá)載體并分別單獨(dú)或聯(lián)合電穿孔轉(zhuǎn)染PDLSCs,實(shí)時(shí)定量PCR和Western b

11、lot驗(yàn)證了mRNA和蛋白的過(guò)表達(dá)水平;(3)PDLSCs成骨誘導(dǎo)7 d,ERRα過(guò)表達(dá)上調(diào)ALP、下調(diào)RUNX2和OPN的mRNA表達(dá),PGC-1α過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)ALP、COL1A1和RUNX2而下調(diào)OPN mRNA的表達(dá),ERRα+PGC-1α過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)ALP、COL1A1和RUNX2的mRNA表達(dá),而對(duì)OCN、OPN的mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響;(4)XCT790不改變ERRα的mRNA表達(dá)水平,而通過(guò)下調(diào)ERRα蛋白和PGC-1