Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)炎癥狀態(tài)下牙周膜干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、牙周炎是一類以牙齦炎癥和牙槽骨吸收為主要特征的慢性炎癥性疾病?，F(xiàn)有的治療方法如牙周刮治，甚至引導(dǎo)組織再生術(shù)等，均不能獲得牙周組織的完全再生。牙周膜干細(xì)胞（periodontalligamentstemcells,PDLSCs）的發(fā)現(xiàn)為牙周炎的治療提供了新的思路和方法。近年來已有許多研究報(bào)導(dǎo)，PDLSCs復(fù)合組織工程支架材料可在體內(nèi)形成牙骨質(zhì)/牙周膜樣結(jié)構(gòu)。牙周炎患者的牙周組織再生是受到抑制的，然而關(guān)于炎癥狀態(tài)下PDLSCs的生物學(xué)行為和

2、牙周組織再生能力的改變卻鮮有報(bào)道，其具體分子機(jī)制尚不清楚。
　　干細(xì)胞內(nèi)部有許多錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)控著干細(xì)胞的命運(yùn)和數(shù)目，其中Wnt信號(hào)通路在骨的形成和改建過程中發(fā)揮了重要作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)在炎癥牙周組織來源的PDLSCs中檢測到了高表達(dá)的β-catenin，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能與炎癥狀態(tài)下PDLSCs的成骨分化有關(guān)。糖原合成激酶3β（glycogensynthasekinase-3β,GSK3β）

3、是Wnt經(jīng)典通路中非常重要的負(fù)性調(diào)控因子，參與了包括炎癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展?；谶@些研究，我們提出假設(shè)：炎癥微環(huán)境可造成PDLSCs中GSK3β的功能發(fā)生改變，繼而引發(fā)下游Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活和成骨分化能力的下降。
　　實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：
　　1.炎癥牙周組織來源的牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)行為的觀察。
　　目的：通過比較正常及炎癥組織來源的PDLSCs（H-PDLSCs和P-PDLSCs）增殖和分

4、化能力，探討炎癥微環(huán)境對(duì)PDLSCs生物學(xué)行為的影響。方法：1）從正常及炎癥感染的牙周組織中分離、培養(yǎng)PDLSCs，并采用有限稀釋法進(jìn)行克隆純化。2）流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記。3）通過MTT細(xì)胞生長曲線、克隆形成率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡，比較兩種PDLSCs的增殖能力。4）將正常及炎癥PDLSCs分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)。通過茜素紅染色、ALP染色及ALP活性、實(shí)時(shí)定量PCR檢測成骨相關(guān)基因Runx2、ALP、BSP、O

5、CNmRNA的表達(dá)，比較兩種PDLSCs的成骨分化能力；通過油紅O染色，比較兩種PDLSCs的成脂分化能力。5）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激H-PDLSCs、P-PDLSCs和單核細(xì)胞，24h收集培養(yǎng)上清，ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。結(jié)果：1）在炎癥感染的牙周組織中同樣含有牙周膜干細(xì)胞，兩種PDLSCs都呈成纖維細(xì)胞樣的紡錘形，具有克隆形成能力，且細(xì)胞表面分子的表達(dá)基本一致

6、。2）MTT細(xì)胞生長曲線、克隆形成率和流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果均表明，P-PDLSCs的增殖能力要高于H-PDLSCs；細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，兩種PDLSCs的凋亡情況沒有顯著差別，但P-PDLSCs在成骨誘導(dǎo)之后凋亡明顯增加。3）茜素紅染色及定量、ALP染色及ALP活性、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果說明P-PDLSCs的成骨分化能力要明顯低于H-PDLSCs；油紅O染色P-PDLSCs的脂滴形成量要明顯少于H-PDLSCs，說明P-PDLSCs的成

7、脂分化能力也受到了抑制。4）在LPS刺激下單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，其中TNF-α的上調(diào)最為顯著，但H-PDLSCs和P-PDLSCs均不會(huì)分泌炎性因子；使用TNF-α刺激H-PDLSCs可明顯抑制其成骨分化。結(jié)論：1）在炎癥微環(huán)境的作用下，PDLSCs的增殖能力提高，而成骨、成脂分化能力下降。2）在炎癥微環(huán)境中，TNF-α是抑制PDLSCs成骨分化的關(guān)鍵因子之一。
　　2.炎癥狀態(tài)下牙周膜干細(xì)胞成骨能力下降的

8、機(jī)制研究。
　　目的：研究炎癥微環(huán)境抑制牙周膜干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制。方法：1）成骨誘導(dǎo)后，Westernblot檢測Wnt經(jīng)典信號(hào)通路相關(guān)蛋白GSK3β/p-GSK3β、β-catenin在H-PDLSCs和P-PDLSCs中的表達(dá)。2）使用TNF-α刺激H-PDLSCs，Westernblot檢測GSK3β/p-GSK3β、β-catenin的蛋白表達(dá)情況。3）雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性。以TO

9、PFlash為報(bào)告質(zhì)粒，F(xiàn)OPFlash為陰性對(duì)照，共轉(zhuǎn)染pRL-TK作為內(nèi)參對(duì)照；用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染。4）在成骨誘導(dǎo)時(shí)使用LiCl或Wnt3a處理H-PDLSCs，茜素紅染色和ALP染色觀察PDLSCs成骨分化的情況。5）siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)β-catenin，成骨誘導(dǎo)時(shí)加入TNF-α，7d后ALP染色觀察PDLSCs成骨能力的變化。結(jié)果：1）Westernblot結(jié)果顯示P-PDLSCs中p-GSK3β和β-ca

10、tenin的蛋白表達(dá)水平較H-PDLSCs增多，GSK3β總蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。成骨誘導(dǎo)后，兩種PDLSCs中p-GSK3β和β-catenin的表達(dá)均有所減弱。TOPFlash/FOPFlash熒光素酶檢測，TNF-α處理組β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性要明顯高于對(duì)照組。說明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在炎癥狀態(tài)下PDLSCs的成骨分化過程中起著負(fù)向調(diào)控的作用，并與GSK3β的活性抑制有關(guān)。2）p-GSK3β的表達(dá)

11、隨TNF-α的刺激呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性的增加；同時(shí)，在TNF-α的刺激下，無論是在細(xì)胞全蛋白還是核蛋白中，β-catenin的蛋白表達(dá)水平均隨著刺激濃度和時(shí)間的增加而增加。3）在使用LiCl抑制GSK3β活性或Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，PDLSCs的成骨分化受到抑制，這與TNF-α對(duì)PDLSCs成骨分化的作用相同。4）使用小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)β-catenin后，ALP染色結(jié)果顯示，在TNF-α刺激下，s