β-catenin siRNA阻斷Wnt-β-catenin信號通路對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：通過沉默Wnt/β-catenin信號通路的核心蛋白β-catenin，探討其與腎纖維化的關(guān)系，為慢性腎臟病的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：1、根據(jù) shRNA設計原則，設計針對β-catenin基因的有效靶點，構(gòu)建β-catenin基因特異性siRNA慢病毒載體，并用293T細胞轉(zhuǎn)染法測定慢病毒滴度。
　　2、設計四組（N=3）不同劑量的陰性慢病毒濃縮液，劑量分別為1×105 ifu、1×106 ifu、1×107

2、ifu、1.5×107 ifu，分別注射于大鼠腎臟被膜下，3天后殺鼠取新鮮腎組織制作冰凍切片，觀察慢病毒的感染效率，為后續(xù)實驗摸索注射的最佳劑量。
　　3、128只雄性SD大鼠（8周齡、200-250g）隨機分為4組：①模型組（UUO組,N＝32）；②假手術(shù)組（Sham組,N＝32）；③β-catenin基因沉默組（沉默組，N＝32）；④陰性沉默組（陰性組，N＝32）。分別于術(shù)后第3、7、10、14天每組各處死8只大鼠，收集腎組織

3、標本，通過HE染色、Masson染色觀察腎組織形態(tài)及腎纖維化改變；通過免疫組織化學染色檢測α-SMA和β-catenin蛋白的表達部位；以及Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測α-SMA、β-catenin蛋白及mRNA的表達量。
　　結(jié)果：(1)成功包裝和濃縮慢病毒，在熒光顯微鏡下可見病毒顆粒發(fā)出強的綠色熒光，滴度為2×108TU/ml。(2)冰凍切片：帶有熒光(GFP)的陰性慢病毒siRNA感染相應部位的組織細胞，以

4、滴度為1×107 ifu時感染效率最高。(3)腎組織HE及Masson染色:UUO組大鼠隨梗阻時間的延長，出現(xiàn)皮質(zhì)區(qū)腎小管擴張、變形，間質(zhì)水腫、增寬，并可見炎癥細胞浸潤，后期出現(xiàn)腎小管不同程度閉塞、萎縮或擴張呈囊狀、管腔塌陷，并可見程度不等的間質(zhì)纖維化改變。Sham組大鼠腎皮質(zhì)結(jié)構(gòu)未見異常改變，未見明顯纖維化改變。陰性沉默組改變與UUO組類似，而沉默組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)于四個時間點出現(xiàn)不同程度的損傷，伴隨不同程度的間質(zhì)纖維化改變，在后期同相

5、應時間點的陰性組相比有所減輕。(4)免疫組織化學染色：隨梗阻時間的延長，UUO組表達α-SMA和β-catenin蛋白的腎小管上皮細胞數(shù)目增多；Sham組無明顯變化。沉默β-catenin基因后，表達α-SMA和β-catenin蛋白的腎小管上皮細胞的數(shù)目均在第10天、第14天較相應時間點的陰性沉默組減少。(5)Western blot：①與相應時間點的Sham組相比，UUO組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)α-SMA蛋白于第10、14天升高（P<0.05

6、）；沉默β-catenin基因后，與相應時間點的陰性沉默組相比，第10、14天下降（P<0.05）；②與相應時間點的Sham組相比，UUO組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)β-catenin蛋白于第7、10、14天升高（P<0.05）；沉默β-catenin基因后，與相應時間點的陰性沉默組相比，第10、14天下降（P<0.05）；(6)RT-PCR：①與相應時間點的Sham組相比，UUO組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)α-SMA mRNA于第10、14天升高（P<0.05）

7、；沉默β-catenin基因后，與相應時間點的陰性沉默組相比，第10、14天下降（P<0.05）；②與相應時間的Sham組相比，UUO組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)β-catenin mRNA于第7、10、14天升高（P<0.05）；沉默β-catenin基因后，與相應時間點的陰性沉默組相比，第14天下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：①Wnt/β-catenin信號通路參與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。②特異的β-catenin siRNA可以明顯下調(diào)U