HBX對Wnt-β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響研究.pdf

1、目的：利用HBX腺病毒質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株L02，觀察HBX對B-catenin表達(dá)量及轉(zhuǎn)錄活性的影響，研究HBX與Wnt／13．catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要信號分子的相互作用，確定HBX與p．catenin的內(nèi)在聯(lián)系，旨在探討HBV相關(guān)性HCC的發(fā)生機(jī)制，闡明Wnt／[3一catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中的重要作用。 方法：構(gòu)建HBX的腺病毒(Adenovims)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株L02，確定HBX

2、在肝細(xì)胞中高效表達(dá)；Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中B-catenin表達(dá)水平的改變；熒光素酶報(bào)告基因檢測13-catenin的活性變化；免疫共沉淀分析HBX與GSK313、Axin的相互作用，初步探討HBX對Wnt／B．catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生影響的作用機(jī)理。 結(jié)果：HBX在肝細(xì)胞中的表達(dá)：重組腺病毒質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率較高，當(dāng)MOI為80時(shí)，細(xì)胞感染效率為70％左右；并通過westernbl

3、otting在轉(zhuǎn)染Ad-HBX-GFP的L02細(xì)胞中檢測到HBX的穩(wěn)定表達(dá)。免疫印跡法檢測結(jié)果：轉(zhuǎn)染Ad-HBX-GFP組和轉(zhuǎn)染Ad-GFP組以及未轉(zhuǎn)染腺病毒載體組(空白組)三組蛋白在相對分子量93KD附近檢測到一條顯色區(qū)帶，轉(zhuǎn)染Ad-GFP組和空白組的條帶較弱，灰度值分別為102．18±2．56和101．45±3．66，兩者差別無顯著性(P>0．05)；而轉(zhuǎn)染Ad-HBX-GFP組的條帶比轉(zhuǎn)染Ad-GFP組和空白組的條帶顯色粗、濃，其

4、灰度值為132．11±12．48，兩者差別有顯著性(P<0．05)，說明轉(zhuǎn)染Ad-HBX-GFP的細(xì)胞中p．catenin蛋白表達(dá)量明顯增高。熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果：轉(zhuǎn)染Ad-GFP組和空白組TOP熒光素酶活性是陰性對照組的14倍左右，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)；而轉(zhuǎn)染Ad-HBX-GFP組的TOP熒光素酶活性明顯增強(qiáng)，為陰性對照的n倍左右，P<0．05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染Ad-HBX-GFP后24h和36hTOP熒光素酶

5、活性無顯著差異(P>0．05)。免疫共沉淀分析結(jié)果~HBX蛋白在體外與GSK3β和Axin不存在直接的牢固型蛋白．蛋白相互作用。 結(jié)論：1．重組腺病毒載體在體外能有效轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株L02，轉(zhuǎn)染效率高，受感染細(xì)胞能有效表達(dá)重組HBX蛋白。2．HBX增加了肝細(xì)胞中B—catenin的表達(dá)量及轉(zhuǎn)錄活性，從而激活Wnt／β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這種激活作用并不是通過HBX與該通路中的主要信號分子β-catenin、Axin、GSK