Wnt-β-catenin信號(hào)通路調(diào)控原發(fā)性肝癌形成的機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（primer hepitia cancer，PHC）是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，中國(guó)是原發(fā)性肝癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均位居世界首位。由于其發(fā)病較為隱匿、發(fā)病快、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，加之缺乏有效的治療手段，嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此，闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制將有助于其診斷和治療。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路不僅在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、組織修復(fù)中起重要調(diào)控作用，而且與腫瘤包括原發(fā)性肝癌的發(fā)生也密切相關(guān)，已經(jīng)

2、成為當(dāng)今肝癌研究的熱點(diǎn)。Wnt/β-catenin信號(hào)可通過關(guān)鍵蛋白β-catenin入核介導(dǎo)與細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、血管生成相關(guān)等靶基因表達(dá)，如c-myc、cyclin-D1、VEGF、MMPs。Wnt/β-catenin信號(hào)異常在許多肝臟疾病中均有報(bào)導(dǎo)，如慢性肝炎、肝纖維化，提示其可能參與肝癌形成過程中各個(gè)環(huán)節(jié)促進(jìn)肝癌形成。因此，明確Wnt/β-catenin信號(hào)通路在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及詳細(xì)機(jī)制，可以為肝癌的診斷和治療提供新思路。

3、
　　β-Catenin在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)研究在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)導(dǎo)，但是未就微量化學(xué)物質(zhì)二乙基亞硝胺（DEN）刺激肝炎產(chǎn)生，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝脂肪化及肝纖維化進(jìn)程，最終誘發(fā)原發(fā)性肝癌的病理進(jìn)程做詳細(xì)探討，也未見微量化學(xué)物質(zhì)經(jīng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控原發(fā)性肝癌形成的動(dòng)態(tài)變化研究報(bào)導(dǎo)。因此，本研究擬通過利用微量化學(xué)物質(zhì)DEN誘發(fā)小鼠原發(fā)性肝癌，研究Wnt/β-catenin信號(hào)在肝炎、肝脂肪化、肝纖維化、肝癌等病理階段過程

4、中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其調(diào)控原發(fā)性肝癌形成的分子機(jī)制，為臨床藥物干預(yù)原發(fā)性肝癌提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的：
　　探究β-catenin在原發(fā)性肝細(xì)胞癌小鼠模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)以及其對(duì)肝癌形成的調(diào)控機(jī)制，為肝癌形成機(jī)制提供理論依據(jù)，為肝癌的診斷和治療提供新思路。方法：
　　1.采用DEN1.65 mg/10 g經(jīng)口給藥，建立小鼠原發(fā)性肝癌模型，利用H&E染色和Masson染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化。
　　2.利用免疫組織染色法和

5、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)并分析炎癥因子（COX-2，TNF-α）、脂肪化因子（PPAR-γ，AP-2）、纖維化因子（TGF-β1，Smad-2）等蛋白與核酸的表達(dá)變化規(guī)律。
　　3.利用免疫組織染色法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)并分析β-catenin mRNA和其蛋白的表達(dá)水平，并探討它和COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2等因子的相關(guān)性。
　　4.體外培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞，利用Wnt

6、3a（100 ng/ml）刺激HepG-2細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western Blotting法分析β-catenin mRNA表達(dá)和其蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中的表達(dá)分布差異。
　　5.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)并分析Wnt3a（100 ng/ml）刺激后，HepG-2細(xì)胞中COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2 mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間（共3

7、5周）模型組小鼠體重顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），但模型組小鼠體重仍然呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；化學(xué)物質(zhì)DEN刺激10周后，模型組小鼠肝臟指數(shù)逐漸升高，第25周后顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），而正常對(duì)照組肝臟指數(shù)無明顯變化。
　　2. HE染色結(jié)果顯示化學(xué)物質(zhì)DEN刺激后的第10周小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象；第15周肝臟出現(xiàn)脂肪變性；第20周肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，膠原纖維沉積；第25周肝細(xì)胞脂肪變性進(jìn)一步加重，

8、出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；第30周肝細(xì)胞核質(zhì)比增大、異形度增加、高倍鏡下可見有絲分裂相。Masson染色結(jié)果顯示，化學(xué)物質(zhì)DEN刺激后第10周、第15周，未見明顯的膠原蛋白沉積；而化學(xué)物質(zhì)DEN刺激后第20-25周，肝門脈域出現(xiàn)纖維組織增生；第30-35周增生的膠原束包繞分割肝小葉，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，假小葉形成。
　　3. RT-PCR結(jié)果顯示化學(xué)物質(zhì) DEN刺激后第10周時(shí)模型組肝臟 COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、T

9、GF-β1、Smad-2 mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），且均有逐漸升高趨勢(shì)，而正常對(duì)照組肝臟上述因子mRNA水平無明顯變化。比較上述因子 mRNA水平在腫瘤組織、鄰近癌旁組織和正常肝臟組織中表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)上述因子 mRNA水平在腫瘤組織中表達(dá)最高、其次為在鄰近癌旁組織，而在正常肝臟組織的相應(yīng)表達(dá)最低，各組比較均有顯著差異（P<0.05）。免疫染色結(jié)果表明相對(duì)于正常組肝臟組織，模型組肝臟組織中COX-2、PPAR-γ、A

10、P-2、TGF-β1、Smad-2等蛋白呈陽性表達(dá)，且隨著化學(xué)物質(zhì) DEN刺激后時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。
　　4.免疫組織染色結(jié)果顯示，β-catenin蛋白在化學(xué)物質(zhì)DEN刺激后第10周主要在肝細(xì)胞細(xì)胞漿表達(dá)，有少量在核內(nèi)表達(dá)，并呈明顯的時(shí)間依賴關(guān)系；第30周、35周，β-catenin主要在肝細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示化學(xué)物質(zhì)DEN刺激后第10周時(shí)模型組肝臟β-catenin mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.0

11、5），且有逐漸升高趨勢(shì)，而正常對(duì)照組肝臟β-catenin mRNA水平無明顯變化。RT-PCR結(jié)果肝癌組織中β-catenin mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.05）。免疫組織染色結(jié)果顯示，肝癌組織中β-catenin蛋白的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽性率顯著高于癌旁組織（P<0.05）。
　　5.將模型組分為兩組：β-catenin核陽性表達(dá)組（記做β-catenin N+）和β-catenin核陰性表達(dá)組（記做β-catenin

12、N-）。比較β-catenin的核表達(dá)差異與COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，顯示β-catenin N+組上述因子的mRNA表達(dá)水平均顯著高于β-catenin N-組（P<0.05）。
　　6.將所有成瘤樣本（15例）分為兩組：β-catenin核陽性表達(dá)組（記做β-catenin N+）和β-catenin核陰性表達(dá)組（記做β-catenin N-）。β-cat

13、enin N+組肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和有絲分裂相數(shù)均顯著高于β-catenin N-組（P<0.05）。
　　7.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，RT-PCR結(jié)果顯示，Wnt3a（100 ng/ml）刺激 HepG-2細(xì)胞不同時(shí)間6 h、18 h和24 h后，β-catenin mRNA呈時(shí)間依賴升高。Western blotting結(jié)果顯示，β-catenin總蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、核蛋白水平也呈時(shí)間依賴增加。
　　8. RT-PCR結(jié)果顯示，Wn

14、t3a成功激活 HepG-2細(xì)胞 Wnt/β-catenin信號(hào)，COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2 mRNA表達(dá)均有不同程度升高。
　　結(jié)論：
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過上調(diào)炎癥因子（COX-2，TNF-α）、脂肪化因子（PPAR-γ，AP-2）、纖維化因子（TGF-β1，Smad-2）來刺激炎癥產(chǎn)生，促進(jìn)脂肪化和纖維化病理進(jìn)程，最終誘發(fā)原發(fā)性肝癌形成。Wnt/β-