經典Wnt-β-catenin信號通路在椎間盤退變中的作用及機制研究.pdf

1、本研究由如下四部分構成：
　　 一、β--catenin 在人退變椎間盤髓核組織中的表達及意義β--catenin 在人退變椎間盤髓核組織中的表達及意義
　　 目的：檢測β連環(huán)蛋白（β-catenin）在人退變椎間盤髓核和正常髓核組織中表達差異，初步探討經典Wnt/β-catenin信號通路與椎間盤退變的關系。
　　 方法：收集2007年5月至2008年3月于我院手術的腰椎間盤突出癥患者髓核組織標本28例（男17

2、例，女11例）作為試驗組，平均年齡45歲（26～63歲）；收集同期因腰段脊柱創(chuàng)傷手術治療的患者髓核組織標本12例（男9例，女3例）作為對照組，平均年齡35歲（18～55歲）。采用實時熒光定量RT-PCR法和蛋白印跡法（western-blot）分別檢測退變組和創(chuàng)傷組椎間盤髓核組織β-catenin mRNA與蛋白的表達，比較其差異并進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：β-catenin mRNA與蛋白表達在退變組中均明顯高于創(chuàng)傷組，熒

3、光定量RT-PCR 比值約為2.85：1；蛋白印跡各組平均光密度比值分別為0.76±0.04，0.13±0.02，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 結論：β-catenin 在人退變椎間盤髓核組織中表達增高，提示Wnt/β-catenin信號通路可能在椎間盤退變過程中發(fā)揮了作用。
　　 二、TNF--α注射構建兔椎間盤退變動物模型中β-catenin 蛋白的表達及意義
　　 目的：通過外源性TNF-α

4、注射構建兔椎間盤退變動物模型，探討該模型中β-catenin 蛋白的表達及意義，以明確炎性細胞因子在促進腰椎間盤退變過程中Wnt/β-catenin信號通路的作用。
　　 方法：選取12只健康成年日本白兔，雌雄隨機，體重2.5～3.0Kg。手術暴露L2～5 3個間隙共36個椎間盤。隨機分為4組，分別注入生理鹽水，TNF-α5ng，TNF-α10ng，TNF-α20ng，于術后第8 周統(tǒng)一處死，取椎間盤髓核組織作HE-番紅0 染色

5、病理切片進行形態(tài)學觀察；各組分別隨機選取4個椎間盤髓核組織標本，采用蛋白印跡法（western-blot）測定β-catenin蛋白含量并比較各組間差異。
　　 結果：HE-番紅0 染色病理切片顯示，在5ng、10ng、20ng組椎間盤組織中髓核細胞數量減少，正常網狀結構破壞，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現肥大空泡樣軟骨細胞，組織基質蛋白聚糖含量明顯降低，番紅0 淡染，表明兔椎間盤退變動物模型構建成功，退變程度與TNF-α濃度相關。生理

6、鹽水對照組椎間盤形態(tài)基本正常，無退變發(fā)生。蛋白印跡結果顯示β-catenin 蛋白含量在注射TNF-α組明顯增加，各組光密度比值分別為：0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和 0.710±0.063，組間差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）且與TNF-α濃度相關。
　　 結論：通過外源性TNF-α盤內注射能夠成功構建兔椎間盤退變動物模型，且退變程度與TNF-α呈濃度依賴性；在退變模型髓核組織中β

7、-catenin蛋白含量增高且與TNF-α濃度相關，提示炎癥細胞因子觸發(fā)了Wnt/β-catenin信號通路，在椎間盤退變過程中可能發(fā)揮了重要作用。
　　 三、綠色熒光蛋白標記的重組DKK-1 腺病毒表達載體的構建
　　 目的：構建綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的DKK1腺病毒表達載體，對表達產物進行鑒定，分離、純化并大量擴增.
　　 方法：構建含配對序列、酶切位點

8、和DKK-1基因序列的PCR 引物，使用PCR技術從DKK1 質粒中提取DKK1基因序列，與pDC315-eGFP 真核表達載體分別進行雙酶切并純化酶切產物，在感受態(tài)大腸桿菌細胞反應體系中構建真核表達載體，提取陽性克隆進行PCR 產物鑒定，同AdMax 腺病毒包裝系統(tǒng)共轉染HEK293細胞重組并包裝出腺病毒載體，培養(yǎng)HEK293細胞進行病毒擴增，按Adeno-X Virus Purification Kit (BD Bioscience

9、s,Clontech)步驟純化重組腺病毒。使用腺病毒轉染正常HEK293細胞，24 小時后觀察GFP熒光表達情況。
　　 結果：PCR 證實重組腺病毒包含DKK-1基因，轉染HEK293細胞后熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光穩(wěn)定表達，蛋白檢測發(fā)現可表達GFP。
　　 結論：成功構建綠色熒光蛋白標記的重組DKK-1 腺病毒表達載體，能感染HEK293細胞并表達目的基因，通過GFP標記可連續(xù)而直接地觀察細胞中的基因表達。

10、>　　 四、DKK1 腺病毒阻斷Wnt信號通路對體外培養(yǎng)兔髓核細胞基質的保護作用
　　 目的：探討Wnt 通路在髓核細胞退變中的生物學機制及DKK1 腺病毒阻斷Wnt信號通路對體外培養(yǎng)兔髓核細胞基質的保護作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)兔椎間盤髓核細胞，取培養(yǎng)第二代細胞隨機分為4組加藥，A組：空白對照組，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組：加入TNF-α20ng/ml作為退變組；C組：加入MOI 為200的Adv-eGFP 腺病毒液，T

11、NF-α20ng/ml作為熒光對照組；D組：加入MOI 為200的Adv-hDKK1 腺病毒液，TNF-α20ng/ml作為實驗組。轉染換液后繼續(xù)培養(yǎng)一周,PT-PCR法檢測不同組β-catenin、II型膠原和MMP-13 mRNA的表達；免疫組織化學染色檢測II型膠原表達；番紅O 染色檢測蛋白聚糖的表達變化，熒光顯微鏡鏡下觀察各組eGFP表達情況。
　　 結果：倒置相差顯微鏡發(fā)現B組和C組髓核細胞數量減少，正常網狀結構破壞，

12、細胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂；A組和D細胞形態(tài)基本正常，部分細胞互相粘附。PT-PCR法檢測不同組β-catenin、II型膠原和MMP-13 mRNA發(fā)現:β-catenin mRNA 在A組基本不表達，B組和C組明顯表達，D組僅少許表達,與內參比值分別為B組0.677，C組0.632，D組0.121；II型膠原mRNA 在A組和D組表達明顯高于B組和C組，與內參比值分別為A組0.652，B組0.159，C組0.214，D組0.638；M

13、MP-13 mRNA 在B組和C組表達明顯高于A組和D組,與內參光密度比值分別為A組0.184，B組0.627，C組0.632，D組0.154。II型膠原免疫組織化學染色顯示A和D組呈現陽性，B組和C組為弱陽性，僅有少數細胞染色，II型膠原蛋白表達明顯降低，番紅染色顯示蛋白聚糖含量在C和B組較A和D組明顯降低，胞外基本無紅染，僅少數細胞周圍淡染。熒光顯微鏡觀察顯示C和D組明顯熒光表達，A組和B組為陰性，表明Adv-hDKK-1 腺病毒成

14、功轉染髓核細胞且表達目的基因。
　　 結論：退變組和熒光對照組細胞發(fā)生退行性改變，β-catenin和MMP mRNA表達明顯增高，II型膠原mRNA和蛋白表達明顯降低，蛋白聚糖含量明顯降低。實驗組細胞形態(tài)正常，β-catenin和MMP-13 mRNA 僅少許表達，II型膠原和蛋白聚糖表達正常。這表明200MOI的Adv-hDKK1 能成功轉染髓核細胞且表達目的基因，DKK1 在TNF誘導的髓核細胞退變過程中阻斷了Wnt/β-