Wnt-β-catenin信號(hào)通路在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、目的：探討應(yīng)用EGF、bFGF誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的的可行性，并進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化中的作用。
　　方法：取4周齡大健康清潔級(jí)SD大鼠骨髓，采用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3代細(xì)胞表面的骨髓基質(zhì)標(biāo)志CD90和造血細(xì)胞標(biāo)志CD45。取P3代細(xì)胞，根據(jù)誘導(dǎo)條件不同分為4組:空白對(duì)照組（1％胎牛血清+DMEM/F-12）、EGF組(20ng/mlEGF+1

2、％胎牛血清+DMEM/F-12)、bFGF組(20ng/mlbFGF+1％胎牛血清+DMEM/F-12)、EGF+ bFGF組(20ng/mlEGF+20ng/mlbFGF+1％胎牛血清+DMEM/F-12)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，誘導(dǎo)7天后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白NSE、GFAP的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)NSE、GFAP、nestin、β-catenin、BDNF、GDNF基因mRNA

3、的變化。
　　結(jié)果：P3代BMSCs大致呈單一的長(zhǎng)梭形或扁平形，緊密漩渦樣排列生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀示CD90表達(dá)高達(dá)98.95％，而CD45表達(dá)僅1.28％;誘導(dǎo)7天后bFGF和EGF+bFGF組細(xì)胞收縮變圓，向四周伸出多個(gè)明顯突起，部分突起間存在連接，表現(xiàn)出典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，而EGF組、空白組變化不明顯;免疫細(xì)胞染色示EGF組GFAP陽性率高于NSE，而bFGF和EGF+bFGF組NSE陽性率高于GFAP; EGF+bFGF組

4、NSE、GFAP陽性率最高，bFGF組次之，與空白對(duì)照組、EGF組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.0042)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫細(xì)胞染色結(jié)果一致。RT-PCR檢測(cè)NSE、GFAPmRNA改變類似于相應(yīng)蛋白改變，但EGF+bFGF組GFAPmRNA表達(dá)量低于bFGF組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);nestin在bFGF組、EGF+bFGF組較空白組及EGF組顯著增高，EGF組低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0

5、.05);β-catenin、BDNF在EGF組、bFGF組、EGF+bFGF組顯著高于空白組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); GDNF在bFGF組、EGF+bFGF組顯著高于其他組，且bFGF組高于EGF+bFGF組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：bFGF、EGF可誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，分化過程中β-catenin、BDNF、GDNF基因表達(dá)增高，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能在B