Wnt-β-catenin信號通路及Osterix在調(diào)控骨量和骨生長中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路是指在Wnt信號作用下通過β-catenin傳導的信號通路。信號傳導過程中,Wnt蛋白與Frizzled家族特異性受體和LRP5/LRP6輔助受體結(jié)合,觸發(fā)細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導,使β-catenin聚集入核,激動靶基因轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和遷移等生物學過程。近年來,大量研究及本課題組前期實驗觀察發(fā)現(xiàn),不同時期的成骨細胞中激活Wnt/β-catenin信號通路均可增加骨量,顯

2、示出在骨質(zhì)疏松等低骨量疾病治療中的良好應用前景。
　　骨細胞占所有骨組織細胞總量的95％以上,最近研究表明,骨細胞具有內(nèi)分泌功能,可作用于成骨細胞、破骨細胞和腎臟等,對骨代謝及骨發(fā)育有重要調(diào)控作用。但目前尚無相關研究報道在骨細胞中持續(xù)激活β-catenin對骨量和骨生長有何作用。鑒于骨細胞的數(shù)量及其在骨量調(diào)控中的重要作用,以及Wnt信號通路在骨量和骨生長中的重要調(diào)控作用,我們認為有必要對骨細胞中持續(xù)激活β-catenin對骨量和骨

3、生長的作用及機制進行觀察。
　　骨硬化蛋白(Sclerostin,SOST)在骨細胞中特異表達,是Wnt/β-catenin信號通路強力抑制因子之一,可抑制骨形成,減少骨量。近年的基礎研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn), SOST中和性抗體可增加骨量,在骨質(zhì)疏松的治療中效果肯定。目前,尚不清楚其具體的作用機制、可能的副作用以及在其他低骨量的病理狀態(tài)中有無作用。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)是在牙本質(zhì)和骨

4、細胞中特異表達的一種蛋白,在骨組織礦化及機體磷代謝中有重要調(diào)控作用。DMP1基因敲除后一個重要的表型是椎體骨量降低。因而我們試圖觀察SOST中和抗體是否可以改善DMP1基因敲除小鼠低骨量的表型,并觀察其是否有副作用。
　　雖然目前Wnt/β-catenin信號通路在骨量和骨生長調(diào)控的重要作用得到證實,但其下游可能相互作用的轉(zhuǎn)錄因子及具體機制尚不清楚。Osterix是成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,在成骨細胞分化及骨形成過程中必不可少。有研

5、究表明,Osterix和Wnt/β-catenin信號通路相互作用,在成骨細胞等的增殖、分化中發(fā)揮重要作用。因而我們推測Osterix可能是Wnt/β-catenin信號通路重要的下游作用分子(之一)。
　　綜上,目前已經(jīng)證實Wnt/beta-catenin信號通路在骨量和骨生長調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但仍存在如上述諸多不明了的問題。為此,我們擬開展以下實驗:1.觀察在骨細胞中持續(xù)激活β-catenin后對骨量和骨生長的影響,并探索其

6、可能機制。2.觀察SOST中和抗體對正常小鼠和一種特殊的低骨量小鼠(DMP1基因敲除小鼠)的骨量和骨生長的調(diào)控作用。3.觀察Osterix對骨量和骨生長的調(diào)控作用,并探索其可能機制。
　　實驗方法:
　　第一部分:骨細胞中持續(xù)激活β-catenin對小鼠骨量和骨生長影響
　　1.建立骨細胞特異性持續(xù)激活β-catenin小鼠模型,并觀察有無骨骼畸形,測量體重和下肢骨長度;
　　2.利用X線攝片、Micro CT,

7、H&E染色等觀察小鼠骨密度及骨組織結(jié)構情況;
　　3.TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)量及功能,BrdU免疫組織化學檢測成骨細胞增殖情況,TUNEL法觀察成骨細胞和生長板肥大層細胞凋亡情況,采用ELISA方法檢測血清中成骨及破骨的生化指標Osteocalcin和CTX1的含量;
　　4.利用免疫組織化學染色檢測成骨細胞標志物RunX2、Osterix,破骨細胞標志物RANKL,骨礦化抑制因子OPN、FGF23,Wnt/β-cate

8、nin信號抑制因子Dkk1,以及血管標記CD31因子的表達;
　　5.采用三點彎曲試驗測試小鼠長骨生物力學特性,硬組織切片鈣化結(jié)節(jié)染色觀察骨組織礦化水平,Masson染色觀察長骨膠原成分含量,測定血清中堿性磷酸酶及鈣、磷含量,觀察小鼠鈣磷代謝是否正常;
　　6.小鼠長骨原代成骨細胞及骨細胞體外分離培養(yǎng),并進行成骨誘導,茜素紅染色觀察礦化水平,提取細胞總RNA,實時定量PCR檢測骨形成與骨吸收相關基因Dkk1、RANKL、OP

9、G的表達。
　　第二部分:SOST中和抗體對正常小鼠和DMP1基因敲除小鼠骨量和骨生長影響
　　1.實驗小鼠的分組給藥:DMP1敲除小鼠與野生型小鼠分別隨機分為SOST中和抗體處理組與對照組。出生后4周及12周開始,處理組給予SOST中和抗體10mg/kg腹腔注射,對照組給予等體積生理鹽水,一周兩次給藥,連續(xù)8周;
　　2.X線攝片、Micro CT掃描及HE染色觀察小鼠椎體骨密度,松質(zhì)骨骨量及骨組織結(jié)構情況;

10、　　3.Safranin O染色觀察骨組織軟骨成分含量,TRAP染色觀察破骨細胞活性;
　　4.免疫組織化學染色檢測成骨與破骨活動相關標志物PHEX、BSP、RANKL、可能是Wnt/β-catenin信號通路重要的下游作用分子(之一)。
　　綜上,目前已經(jīng)證實Wnt/beta-catenin信號通路在骨量和骨生長調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但仍存在如上述諸多不明了的問題。為此,我們擬開展以下實驗:1.觀察在骨細胞中持續(xù)激活β-ca

11、tenin后對骨量和骨生長的影響,并探索其可能機制。2.觀察SOST中和抗體對正常小鼠和一種特殊的低骨量小鼠(DMP1基因敲除小鼠)的骨量和骨生長的調(diào)控作用。3.觀察Osterix對骨量和骨生長的調(diào)控作用,并探索其可能機制。
　　實驗方法:
　　第一部分:骨細胞中持續(xù)激活β-catenin對小鼠骨量和骨生長影響
　　1.建立骨細胞特異性持續(xù)激活β-catenin小鼠模型,并觀察有無骨骼畸形,測量體重和下肢骨長度;

12、>　　2.利用X線攝片、Micro CT, H&E染色等觀察小鼠骨密度及骨組織結(jié)構情況;
　　3. TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)量及功能,BrdU免疫組織化學檢測成骨細胞增殖情況,TUNEL法觀察成骨細胞和生長板肥大層細胞凋亡情況,采用ELISA方法檢測血清中成骨及破骨的生化指標Osteocalcin和CTX1的含量;
　　4.利用免疫組織化學染色檢測成骨細胞標志物RunX2、Osterix,破骨細胞標志物RANKL,骨礦化抑

13、制因子OPN、FGF23,Wnt/β-catenin信號抑制因子Dkk1,以及血管標記CD31因子的表達;
　　5.采用三點彎曲試驗測試小鼠長骨生物力學特性,硬組織切片鈣化結(jié)節(jié)染色觀察骨組織礦化水平,Masson染色觀察長骨膠原成分含量,測定血清中堿性磷酸酶及鈣、磷含量,觀察小鼠鈣磷代謝是否正常;
　　6.小鼠長骨原代成骨細胞及骨細胞體外分離培養(yǎng),并進行成骨誘導,茜素紅染色觀察礦化水平,提取細胞總RNA,實時定量PCR檢測骨

14、形成與骨吸收相關基因Dkk1、RANKL、OPG的表達。
　　第二部分:SOST中和抗體對正常小鼠和DMP1基因敲除小鼠骨量和骨生長影響
　　1.實驗小鼠的分組給藥:DMP1敲除小鼠與野生型小鼠分別隨機分為SOST中和抗體處理組與對照組。出生后4周及12周開始,處理組給予SOST中和抗體10mg/kg腹腔注射,對照組給予等體積生理鹽水,一周兩次給藥,連續(xù)8周;
　　2.X線攝片、Micro CT掃描及HE染色觀察小鼠椎

15、體骨密度,松質(zhì)骨骨量及骨組織結(jié)構情況;
　　3.Safranin O染色觀察骨組織軟骨成分含量,TRAP染色觀察破骨細胞活性;
　　4.免疫組織化學染色檢測成骨與破骨活動相關標志物 PHEX、BSP、RANKL、可能是Wnt/β-catenin信號通路重要的下游作用分子(之一)。
　　綜上,目前已經(jīng)證實Wnt/beta-catenin信號通路在骨量和骨生長調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但仍存在如上述諸多不明了的問題。為此,我們擬

16、開展以下實驗:1.觀察在骨細胞中持續(xù)激活β-catenin后對骨量和骨生長的影響,并探索其可能機制。2.觀察SOST中和抗體對正常小鼠和一種特殊的低骨量小鼠(DMP1基因敲除小鼠)的骨量和骨生長的調(diào)控作用。3.觀察Osterix對骨量和骨生長的調(diào)控作用,并探索其可能機制。
　　實驗方法:
　　第一部分:骨細胞中持續(xù)激活β-catenin對小鼠骨量和骨生長影響
　　1.建立骨細胞特異性持續(xù)激活β-catenin小鼠模型,

17、并觀察有無骨骼畸形,測量體重和下肢骨長度;
　　2.利用X線攝片、Micro CT,H&E染色等觀察小鼠骨密度及骨組織結(jié)構情況;
　　3.TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)量及功能,BrdU免疫組織化學檢測成骨細胞增殖情況,TUNEL法觀察成骨細胞和生長板肥大層細胞凋亡情況,采用ELISA方法檢測血清中成骨及破骨的生化指標Osteocalcin和CTX1的含量;
　　4.利用免疫組織化學染色檢測成骨細胞標志物RunX2、Ost

18、erix,破骨細胞標志物RANKL,骨礦化抑制因子OPN、FGF23,Wnt/β-catenin信號抑制因子Dkk1,以及血管標記CD31因子的表達;
　　5.采用三點彎曲試驗測試小鼠長骨生物力學特性,硬組織切片鈣化結(jié)節(jié)染色觀察骨組織礦化水平,Masson染色觀察長骨膠原成分含量,測定血清中堿性磷酸酶及鈣、磷含量,觀察小鼠鈣磷代謝是否正常;
　　6.小鼠長骨原代成骨細胞及骨細胞體外分離培養(yǎng),并進行成骨誘導,茜素紅染色觀察礦化

19、水平,提取細胞總RNA,實時定量PCR檢測骨形成與骨吸收相關基因Dkk1、RANKL、OPG的表達。
　　第二部分:SOST中和抗體對正常小鼠和DMP1基因敲除小鼠骨量和骨生長影響
　　1.實驗小鼠的分組給藥:DMP1敲除小鼠與野生型小鼠分別隨機分為SOST中和抗體處理組與對照組。出生后4周及12周開始,處理組給予SOST中和抗體10mg/kg腹腔注射,對照組給予等體積生理鹽水,一周兩次給藥,連續(xù)8周;
　　2.X線攝