基于Wnt-β-catenin信號(hào)通路探討清腎顆粒抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本課題以 Wnt/β-catenin信號(hào)通路為研究的關(guān)鍵點(diǎn)，并在我們以前的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討清腎顆?？鼓I臟纖維化的作用機(jī)制。觀察單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）模型大鼠腎腎組織中纖維連接蛋白(fibronectin， FN)、Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Wnt1、P-GSK-3β、

2、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、β-catenin等蛋白表達(dá)情況及清腎顆粒對(duì)上述蛋白表達(dá)的影響；探討 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎組織上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）及促進(jìn)腎臟纖維化過程中的作用及清腎顆粒是否能夠抑制該信號(hào)通路的活性，減輕腎組織 EMT，減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，起到抗腎臟纖維化的作用，以明確其抗腎臟纖維化的作用機(jī)制，為防治腎臟纖維化新的治療靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)

3、觀察UUO大鼠非梗阻側(cè)腎臟病理形態(tài)學(xué)改變及清腎顆粒的干預(yù)作用，從中醫(yī)整體觀角度探索濕熱血瘀證對(duì)大鼠非梗阻側(cè)腎臟的影響，并為清熱化濕祛瘀法“治未病”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　清潔級(jí)2月齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，喂養(yǎng)7天，完全適應(yīng)外周環(huán)境，排除環(huán)境應(yīng)激干擾。按單純隨機(jī)的方法，抽樣分為：正常組、清腎顆粒組、假手術(shù)組、貝那普利組和模型組，每個(gè)組平均有12只大鼠。實(shí)驗(yàn)前所有的大鼠稱體重，收集24小時(shí)尿液及血清。

4、以 UUO法制備腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，假手術(shù)組不結(jié)扎輸尿管。清腎顆粒組以0.4g/ml的清腎顆粒溶于溫水中，按1ml/100g的劑量灌胃，貝那普利組以0.16g/ml的貝那普利溶于溫水中，按1ml/100g的劑量灌胃，模型組、假手術(shù)組及正常組均按1ml/100g劑量給予溫水灌胃。各組大鼠每日灌胃一次，療程為4周。實(shí)驗(yàn)大鼠療程結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血并取雙側(cè)腎臟，分別稱腎重，術(shù)前稱體重，留取各組大鼠24小時(shí)尿液。生化法檢測各組大鼠治療前后的血清

5、 BUN、Scr和24小時(shí)尿蛋白定量；HE及Masson染色觀察雙側(cè)腎臟病理形態(tài)學(xué)變化；免疫組化及 Western blot法半定量檢測梗阻側(cè)腎小管間質(zhì)Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白（FN）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白等的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及Western blot法檢測腎組織Wnt1、P-GSK-3β、β-catenin等mRNA及蛋白的表達(dá).
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠體重變化比較：治療前各種大

6、鼠體重水平相當(dāng)（P>0.05）。治療后：各組大鼠體重均有增長，正常組與假手術(shù)組體重增長最明顯，兩組體重增長無明顯差異；清腎顆粒組、貝那普利組與模型組相比，體重明顯升高（P<0.01），其中清腎顆粒組體重升高較貝那普利組明顯（P<0.05）。
　　2.各組大鼠血清BUN、Scr比較：治療前各組大鼠BUN、Scr之間比較水平相當(dāng)（P>0.05）。治療后：與假手術(shù)組比較，清腎顆粒組、貝那普利組、模型組大鼠 BUN、Scr均高于假手術(shù)組（

7、P<0.01）。與模型組比較，清腎顆粒組和貝那普利組大鼠 BUN、Scr均低于模型組（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠BUN、Scr低于貝那普利組（P<0.05）。
　　3.各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量比較：各組大鼠治療前24小時(shí)尿蛋白定量比較水平相當(dāng)（P>0.05）。治療后：與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量均較假手術(shù)組增多（P<0.01）；與模型組比較，清腎顆粒組、貝那普利組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量均低

8、于模型組（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量低于貝那普利組（P<0.05）。
　　4.各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化：組織病理學(xué)結(jié)杲顯示，沒有進(jìn)行造模的大鼠，腎臟的病理結(jié)構(gòu)都沒有明顯的異常。但是所有造模的大鼠的腎臟的小管管腔明顯擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞脫落、空泡變性，腎小管間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤、腎間質(zhì)藍(lán)染膠原纖維沉積明顯，腎間質(zhì)損傷指數(shù)及膠原相對(duì)面積明顯升高。與模型組比較，清腎顆粒組上述病理改變明顯減輕。貝

9、那普利組病變介于模型組與清腎顆粒組之間。
　　5.各組大鼠腎組織免疫組化法檢測：與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎小管間質(zhì)Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白（FN）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等著色半定量評(píng)分均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較：清腎顆粒組、貝那普利組大鼠上述蛋白半定量評(píng)分均低于模型組（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠上述蛋白半定量評(píng)分低于貝那普利組（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎

10、小管間質(zhì)E-cadherin著色半定量評(píng)分均低于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，清腎顆粒組、貝那普利組大鼠E-cadherin著色半定量評(píng)分均高于模型組高（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠E-cadherin著色半定量評(píng)分高于貝那普利組（P<0.05）。
　　6.各組大鼠腎組織Western blot法檢測：與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎組織Col-Ⅰ、FN、α-SMA、Wnt1、P-GSK-3β、β-ca

11、tenin等蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，清腎顆粒組、貝那普利組大鼠上述蛋白表達(dá)均低于模型組（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠上述蛋白表達(dá)低于貝那普利組（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎組織E-cadherin表達(dá)均低于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，清腎顆粒組、貝那普利組大鼠E-cadherin表達(dá)均高于模型組高（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠E-cadh

12、erin表達(dá)高于貝那普利組（P<0.05）。
　　7.各組大鼠腎組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測：與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎組織Wnt1、P-GSK-3β、β-catenin等mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，清腎顆粒組、貝那普利組大鼠上述蛋白mRNA表達(dá)均低于模型組（P<0.01）。與貝那普利組比較，清腎顆粒組大鼠上述蛋白mRNA表達(dá)低于貝那普利組（P<0.05）。
　　8.各組大鼠非梗阻側(cè)腎臟病理

13、形態(tài)學(xué)變化：清腎顆粒組大鼠非梗阻側(cè)腎重/體重比值較 UUO模型組大鼠明顯降低；非梗阻側(cè)腎臟 HE染色及Masson染色提示，清腎顆粒組腎小球充血，系膜輕度增生，腎髓質(zhì)內(nèi)少部分腎小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)偶見壞死脫落上皮細(xì)胞，間質(zhì)充血減輕、輕度水腫，整體病理變化較模型組減輕，系膜區(qū)、腎間質(zhì)綠染膠原纖維沉積較模型組減少；腎間質(zhì)損傷指數(shù)及膠原蛋白相對(duì)面積較模型組明顯降低，提示清腎顆?？筛纳芔UO大鼠非梗阻側(cè)腎臟病理損害，而與貝那普利比較，療效無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

14、異。
　　結(jié)論：
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化參與UUO模型大鼠腎纖維化發(fā)病過程，清腎顆?？筛纳芔UO模型大鼠腎功能，減少尿蛋白排泄，抑制腎間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能通過下調(diào)Wnt1、P-GSK-3β、β-catenin等的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化，從而上調(diào)E-cadherin表達(dá)，減少α-SMA表達(dá)，抑制腎小管EMT，減少Col-Ⅰ、FN等細(xì)胞外基質(zhì)的生成，發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用。同時(shí)清腎