鹽霉素抑制Wnt-β-catenin信號通路誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞凋亡的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　通過無血清懸浮微球方法培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，建立乳腺癌干細(xì)胞的體外模型并分析其生物學(xué)特性;研究鹽霉素對乳腺癌干細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用，分析鹽霉素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、乳腺癌干細(xì)胞體外模型的建立:無血清懸浮微球技術(shù)培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，用倒置顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)及生長方式的變化;免疫熒光標(biāo)記法檢測其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、

2、CD24的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測其細(xì)胞周期的變化和CD44+/CD24-/low乳腺癌干細(xì)胞的富集效率。
　　2、鹽霉素誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞凋亡的機(jī)制:MTT法檢測鹽霉素對乳腺癌微球細(xì)胞增殖的影響;細(xì)胞形態(tài)學(xué)及FITC-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)法檢測鹽霉素對乳腺癌微球細(xì)胞凋亡的影響;PI單染法檢測鹽霉素對乳腺癌微球細(xì)胞的細(xì)胞周期變化;Westernblotting檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9、PARP、Bcl

3、-2、Bax、β-catenin、survivin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、在無血清添加生長因子的懸浮培養(yǎng)液中，細(xì)胞呈游離狀態(tài)，并以大小不等的微球方式進(jìn)行生長;與乳腺癌MCF-7普通貼壁細(xì)胞相比，懸浮細(xì)胞分裂期(S)數(shù)目減少，靜止期(G1)數(shù)目增多;CD44分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)無明顯差異，CD24分子在懸浮細(xì)胞中的表達(dá)含量明顯減少;CD44+/CD24-/low表型細(xì)胞在懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中所占比例分別為87.0±

4、0.43％和40.1±1.05％。
　　2、鹽霉素對乳腺癌微球細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性，24h鹽霉素作用乳腺癌微球細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為4.97±1.96μM。乳腺癌微球細(xì)胞經(jīng)鹽霉素處理后，倒置顯微鏡觀察顯示微球體逐漸解聚，密度降低，細(xì)胞出現(xiàn)水腫、固縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象;FITC-AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)法檢測顯示細(xì)胞凋亡率隨鹽霉素濃度的增加而增大;PI單染法顯示細(xì)胞凋亡的過程中可能伴有細(xì)胞周期的改變。Wes

5、ternblotting結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，乳腺癌微球細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9及其底物多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的表達(dá)明顯降低，cleaved caspase-3、cleavedcaspase-9、cleaved PARP的表達(dá)明顯升高(P＜0.05);Bcl-2家族中促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax表達(dá)升高，抑制凋亡誘導(dǎo)蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P＜0.05); Wnt通路中相關(guān)蛋白β-catenin、sur

6、vivin蛋白表達(dá)均降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、無血清懸浮微球法可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞由CD44+/CD24+亞群向CD44+/CD24-/low亞群細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞周期由S→ G1轉(zhuǎn)變，從而有效富集CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌干細(xì)胞。
　　2、鹽霉素能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞的體外增殖并明顯誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生，其誘導(dǎo)凋亡作用可能與Bcl-2家族中Bcl-2和Bax的相互調(diào)節(jié)并促進(jìn)caspas