葛根提取物對激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Wnt-β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:
　　 通過觀察中藥葛根主要有效成分葛根素對激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的調(diào)節(jié)作用，從Wnt/β-catenin信號通路探討其作用機制，為防治激素所致的股骨頭缺血性壞死提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化SD大鼠BMSCs，并從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長曲線特點和流式細(xì)胞儀檢測BMSCs細(xì)胞的表面抗原等方面進行鑒定。
　　 2.采用MTT比色法得出葛根素對BMSCs生長的

2、最佳濃度，低劑量組使用1/2最佳濃度，藥物中劑量組使用最佳濃度，高劑量組使用2倍最佳濃度。實驗共分5組，空白組:含15％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基100mL(15％FBS100ml);對照組:15％ FBS100ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松儲存液;低劑量組:15％ FBS99.5ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松儲存液+0.5ml＊10-3mol/l葛根素儲存液;中劑量組:15％ FBS99ml+0.1ml*

3、10-3mol/l地塞米松儲存液+1ml＊10-3mol/l葛根素儲存液;高劑量組:15％ FBS98ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松儲存液+2ml＊10-3mol/l葛根素儲存液。
　　 3.上述5組培養(yǎng)6天后，行透射電鏡、油紅0染色、甘油三酯檢測、PCR法檢測Wnt/β-catenin信號通路主要成員Wnt10b、Fz1、GSK3β、β-catenin、TCF4mRNA的表達(dá)及脂肪轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRNA和C/

4、EBPαmRNA的表達(dá)、Western blot法對Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵因子β-catenin蛋白的表達(dá)進行分析等檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞鑒定:形態(tài)學(xué)方面:光鏡下觀察大鼠BMSCs細(xì)胞可見其貼壁生長，細(xì)胞之間緊密相連，成纖維形或紡錘樣，并逐漸融合成片，沿胞體長軸極性排列，集落呈現(xiàn)旋渦狀，經(jīng)過傳代純化后，第三代BMSCs貼壁速度增快，生長迅速，形態(tài)單一，呈長梭形，細(xì)胞核較大，分布均勻，典型的

5、漩渦狀生長，雜細(xì)胞較少;MTT法測OD值后繪制生長曲線呈典型的S形，采用流式細(xì)胞儀對第三代BMSCs進行細(xì)胞表面標(biāo)志抗原檢測結(jié)果示:第3代BMSCs的CD45陽性表達(dá)率約8.24％，CD90陽性率達(dá)99.98％。由此可說明本實驗采用的全骨髓貼壁培養(yǎng)法得到的的細(xì)胞為BMSCs并且純度較高。2.油紅O染色示:空白組未發(fā)現(xiàn)紅染的脂肪細(xì)胞或顆粒，對照組可見脂肪細(xì)胞及較多的紅色脂肪顆粒和脂滴，低劑量組可見少量細(xì)胞內(nèi)含脂肪滴及脂肪顆粒，高、中劑量組

6、未見明顯的脂肪滴，偶見脂肪顆粒，均明顯較低劑量組少。3.電鏡觀察:空白組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞器數(shù)量豐富，胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)脂滴，中劑量組及高劑量組細(xì)胞形態(tài)基本正常，未見明顯脂肪滴，低劑量組細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，胞內(nèi)見數(shù)量較少的脂肪滴及脂肪顆粒，對照組細(xì)胞核退化，細(xì)胞內(nèi)見大量脂肪顆粒及大脂滴。4.甘油三酯檢測:對照組比空白組甘油三酯含量明顯升高，而葛根素各組比對照組均有明顯下降，低劑量組與高、中劑量組相比有差異，高、中劑量組之間比較無明顯差異。與對

7、照組比較，葛根素低、中、高劑量組均較對照組明顯降低。5.RT-PCR: Wnt10b、β-catenin、TCF4mRNA的表達(dá)與空白組比較均有不同程度的明顯下調(diào)，而在葛根素各干預(yù)組則上述指標(biāo)明顯上調(diào)，且均有顯著性差異;GSK3βmRNA及脂肪轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPαmRNA的表達(dá)在對照組均有顯著增加，而葛根素各干預(yù)組較對照組均有顯著降低。6.Western blot:與空白組比較，對照組β-catenin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，葛

8、根素各干預(yù)組較對照組均有不同程度的上升，其中中劑量組對β-catenin蛋白表達(dá)促進效果最好;與對照組相比，中、高劑量組則均有非常顯著性差異，空白組及低劑量組則有顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.葛根素干預(yù)激素誘導(dǎo)BMSCs的成脂分化后，從油紅O染色、電鏡觀察、細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量檢測及PPARγ mRNA、C/EBPαmRNA的表達(dá)差異上，提示葛根素可抑制激素誘導(dǎo)下BMSCs的成脂分化。
　　 2.葛根素對激