Gli1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用.pdf

1、正畸治療過(guò)程中牙位移動(dòng)的原理是:持久的矯治力作用在牙齒上，牙齒周?chē)墓墙M織發(fā)生改建，從而引導(dǎo)牙齒的移動(dòng)，是建立在牙周組織受力后發(fā)生的生物學(xué)改建基礎(chǔ)上，包括牙齒及其周?chē)母街Y(jié)構(gòu)如牙骨質(zhì)、牙周膜及牙槽骨的移動(dòng)改建。但牙的移動(dòng)并不是簡(jiǎn)單的機(jī)械移位，在整個(gè)過(guò)程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共同參與，相互協(xié)調(diào)使牙槽骨發(fā)生選擇性吸收和形成即在壓力側(cè)發(fā)生骨的吸收，張力側(cè)有新骨的形成。而牙槽骨的改建由牙周膜介導(dǎo)，因此牙齒移動(dòng)首先表現(xiàn)為牙周膜現(xiàn)象。在牙周膜中

2、存在一種有多向分化，自我更新，克隆形成能力的干細(xì)胞，即人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)，它為牙周組織包括牙槽骨的再生提供新的細(xì)胞來(lái)源。研究表明，牙周膜干細(xì)胞在應(yīng)力作用下可分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，在牙槽骨改建的起著關(guān)鍵作用。干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化并不是一個(gè)單一的過(guò)程，而是由眾多生長(zhǎng)因子和通路共同作用的結(jié)果。但其具體機(jī)制目前還不十分清楚。
　　Hedgehog信號(hào)參與了胚胎發(fā)育期間各種組織器官的形成，特別是在骨的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起了重要的

3、調(diào)節(jié)作用。研究表明，Hedgehog信號(hào)途徑介導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向成骨，軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化和軟骨骨化的一系列過(guò)程。多種因素可直接或間接通過(guò)調(diào)控Hh信號(hào)通路從而使間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。本課題組前期證實(shí)了周期性張應(yīng)力可促進(jìn)PDLSCs向成骨細(xì)胞分化，并證實(shí)了Hh信號(hào)通路參與了PDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程。
　　Gli1(Gliloma-associated oncogene homoglog)是Hh信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，是該

4、通路激活的最重要標(biāo)志，其如何通過(guò)調(diào)控Hh信號(hào)通路來(lái)影響PDLSCs成骨的分子機(jī)制還少有研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建過(guò)表達(dá)Gli1基因腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染PDLSCs細(xì)胞，探討上調(diào)Gli1基因?qū)DLSCs增殖及其在應(yīng)力作用下成骨分化的影響，為進(jìn)一步了解在應(yīng)力作用下牙齒生理性移位時(shí)牙槽骨的改建機(jī)制而打下一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的通過(guò)體外構(gòu)建Gli1基因腺病毒載體，以此上調(diào)入牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)中Gli1基因的表達(dá)，從而探討其對(duì)人P

5、DLSCs增殖及應(yīng)力成骨分化的影響
　　方法:
　　1.人牙周膜干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定
　　牙齒標(biāo)本是來(lái)自于在臨床上因矯正需要而拔除的牙周健康的新鮮前磨牙（年齡在12～24歲之間），并經(jīng)患者及其家屬知情同意。用含1％雙抗的PBS反復(fù)沖洗牙齒后，在牙根中1/3部位單向刮取牙周膜組織，用酶消化聯(lián)合組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。將用Ⅰ型膠原酶消化45分鐘后的組織混懸液離心后接種于六孔板內(nèi)，二天后第一次換液，之后每3天換液，收集獲得牙

6、周膜細(xì)胞，用流式細(xì)胞分選術(shù)得到PDLSCs。在鏡下通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)和它的克隆形成能力、采用流式細(xì)胞術(shù)分析其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD146、免疫組化法檢測(cè)波形蛋白和角蛋白的表達(dá)以及對(duì)其進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定其干細(xì)胞特性。
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染
　　用攜帶Gli1特異性過(guò)表達(dá)的腺病毒感染PDLSCs，Western blot檢測(cè)PDLSCs中Gli1的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分為三組:即正常細(xì)胞對(duì)照組PDLSCs/正常組、空腺病毒感染的P

7、DLSCs/空載組和由攜帶Gli1特異性過(guò)表達(dá)腺病毒感染的PDLSCs/Gli1過(guò)表達(dá)組。
　　4.細(xì)胞應(yīng)力加載
　　分別取上述第4～6代三組細(xì)胞，接種于BioFlex專(zhuān)用的板底為硅膠模的六孔板內(nèi)培養(yǎng)。使用FX-4000T加載系統(tǒng)（達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化水平）以最大形變量12％，最小形變量為0的正弦波對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)張應(yīng)力的加載，頻率為0.1Hz(即5s拉伸5s放松)，設(shè)定作用時(shí)間為0h(在同等條件下靜置培養(yǎng))、6h、12h、24

8、h。收集細(xì)胞，提取蛋白，Westernblot檢測(cè)Hh信號(hào)通路的相關(guān)效應(yīng)蛋白Gli1、PTCH1和PDLSCs成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、ALP的表達(dá)改變。
　　結(jié)果:
　　1、原代培養(yǎng)出的牙周膜細(xì)胞，鏡下呈三角形或長(zhǎng)梭形，梭形兩端有的有突起和分叉，可與鄰近細(xì)胞突起連接;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選所得PDLSCs陽(yáng)性率為94.8％(細(xì)胞抗體為CD146)。分選所得的PDLSCs具有克隆形成能力;經(jīng)免疫組化檢測(cè)顯示角蛋白表達(dá)陰性，波形蛋

9、白陽(yáng)性，表明其來(lái)源為間充質(zhì)。PDLSCs成脂誘導(dǎo)3周后，胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴，油紅O染色陽(yáng)性，成骨誘導(dǎo)3周后，鏡下可見(jiàn)散在礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽(yáng)性，說(shuō)明所得的PDLSCs具有成骨、成脂等多向分化能力。
　　2、western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Gli1腺病毒后的PDLSCs中基因的Gli1的轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染48h后，Gli1蛋白的表達(dá)量增加[灰度值(0.041±0.024)和(0.148±0.017)，P＜0.05]，說(shuō)

10、明腺病毒載體能夠有效的上調(diào)目的蛋白Gli1的表達(dá)。
　　3、對(duì)三組PDLSCs進(jìn)行同一加載方式和不同加載時(shí)間的應(yīng)力加載后，提取蛋白，western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果如下:
　　(1)PDLSCs/正常組加力后成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2和ALP的表達(dá)較未加力時(shí)升高，說(shuō)明在應(yīng)力刺激下PDLSCs成骨分化的能力增強(qiáng)。
　　(2)PDLSCs/正常組加力后檢測(cè)Hh通路中的Ptch蛋白、下游的Gli1因子及ALP和

11、Runx2的表達(dá)水平都比未加力時(shí)升高，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)有所增加，說(shuō)明Hh信號(hào)通路參與了PDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程。
　　(3)PDLSCs/正常組、PDLSCs/空載組和PDLSCs/Gli1過(guò)表達(dá)組加力后，Ptch、Gli1、Runx2和ALP的表達(dá)水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)先升高后有所降低，只是增加的程度不同，在加力時(shí)間相同情況下，PDLSCs/Gli1過(guò)表達(dá)組Runx2和ALP的表達(dá)水平比PDLSCs/正常組明顯，這表明Gli1具有促進(jìn)P

12、DLSCs應(yīng)力成骨分化作用。
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)用本課題組前期分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來(lái)的人牙周膜干細(xì)胞被證實(shí)有克隆形成能力，高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，在特定誘導(dǎo)環(huán)境下具有多向分化潛能。證明此方法（酶消化聯(lián)合組織塊法)是有效可行的。
　　2.過(guò)表達(dá)Gli1腺病毒感染PDLSCs后，減慢了PDLSCs增殖速率，而Gli1基因可以呈現(xiàn)穩(wěn)定的高表達(dá)。
　　3.細(xì)胞應(yīng)力加載后的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明:PDLSCs的成骨能力隨著加力