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文檔簡介
1、牙周組織的改建在正畸治療過程中比較活躍,且受局部和全身多種因素的調(diào)控,并最終表現(xiàn)為牙槽骨的改建,這種改建主要通過骨不斷吸收和形成,從而使兩者之間達(dá)到一定的平衡來實(shí)現(xiàn)的,且這兩者均有著錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)因素[1]。其中全身性因子主要包括有降鈣素、甲狀腺旁腺素等,局部產(chǎn)生因子主要有細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、PGE2、生長因子等,在這些因子的相互作用下,骨的代謝保持平衡[2]。而在牙槽骨、牙骨質(zhì)等的病理性吸收過程中,炎性因子往往
2、起著重要的作用[3]。
當(dāng)進(jìn)行正畸治療的時(shí)候,矯治力往往容易誘導(dǎo)牙周組織產(chǎn)生無菌性炎性因子,導(dǎo)致局部牙周組織中MMPs表達(dá)增加[4];在牙齒移動(dòng)過程中,如伴有牙根吸收等情況發(fā)生時(shí),牙周組織局部的無菌性炎性因子、MMPs等會(huì)有更明顯的表達(dá)增高表現(xiàn)[5]。而對于這種MMPs表達(dá)增加機(jī)制的研究,一直是包括正畸領(lǐng)域在內(nèi)的口腔醫(yī)學(xué)各學(xué)科中一個(gè)重要的研究課題[6],在探索抑制牙槽骨及牙根組織吸收方面有著廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。
本研
3、究擬探討下列問題:①炎性因子IL-1β對人牙周膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1/-13(matrix metalloproteinase-1/-13,MMP-1/-13)表達(dá)的影響,以分析在牙周組織改建的過程中,一些與骨及牙骨質(zhì)吸收相關(guān)的因子表達(dá)增高的機(jī)制;②絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinakinase,MAPKs)信號(hào)通路對炎性因子IL-1β調(diào)控下人牙周膜細(xì)胞(human periodontal lig
4、ament cells,hPDLCs)MMP-1/-13表達(dá)的影響,并通過阻斷MAPKs信號(hào)通路以研究是否能抑制MMP-1/-13的表達(dá)及抑制牙槽骨及牙根吸收的可能性。本研究主要包括以下內(nèi)容:
一、研究內(nèi)容與方法:
1.IL-1β對hPDLCs表達(dá) MMP-1/-13的影響
選擇不同濃度(0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL)的IL-1β刺激作用于體外培養(yǎng)的hPDLCs24h,選取
5、最佳濃度,分別作用不同時(shí)間(8h、24h、48h、72h),采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)觀察IL-1β在濃度和時(shí)間兩個(gè)方面對hPDLCs中MMP-1、MMP-13表達(dá)的影響。然后選擇最佳濃度與作用時(shí)間,即10ng/mLIL-1β作用于hPDLCs24h,采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和免疫印跡法(western blot)觀察IL-1β對h
6、PDLCs中MMP-1、MMP-13表達(dá)的影響。
2.MAPKs信號(hào)通路在IL-1β對hPDLCs中MMP-1/-13表達(dá)調(diào)控中的作用研究
采用MTT方法,檢測MAPKs通路在24h、48h、72h對hPDLCs生長狀態(tài)的影響。采用 RT-PCR、Western blot檢測 MAPKs信號(hào)通路阻滯劑(ERK通路阻滯劑PD98059、p38通路阻滯劑SB203580、JNK通路阻滯劑JNKinhibitorⅡ)分別作
7、用于10ng/mLIL-1β介導(dǎo)狀態(tài)下的hPDLCs24h,觀察MMP-1/-13mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
二、結(jié)果:
1.IL-1β對hPDLCs表達(dá)MMP-1/-13的影響
1.1.不同濃度IL-1β對hPDLCs表達(dá)MMP-1/-13的影響
根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:與空白對照組相比,0.5ng/mL組與5ng/mL組可以促進(jìn)MMP-1/-13mRNA的表達(dá)(P<0.05),10ng/mL和20
8、ng/mL組促進(jìn)MMP-1/-13mRNA的表達(dá)明顯強(qiáng)于低濃度0.5ng/mL組與5ng/mL組(P<0.05),但在10ng/mL和20ng/mL這兩組之間MMP-1/-13mRNA的表達(dá)并無顯著性差異(P>0.05)。這一結(jié)果提示:IL-1β對hPDLCs中MMP-1/-13mRNA表達(dá)有促進(jìn)作用,其中10ng/mL濃度組對MMP-1/-13mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用最強(qiáng)。
1.2.不同作用時(shí)間的IL-1β對hPDLCs表達(dá)M
9、MP-1/-13的影響
以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為IL-1β濃度的選擇依據(jù),再行IL-1β介導(dǎo)效應(yīng)時(shí)間的梯度研究:10ng/mLIL-1β刺激hPDLCs,檢測hPDLCs中MMP-1/-13mRNA表達(dá)的變化,采集時(shí)間點(diǎn)為8h、24h、48h、72h。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明:與空白對照組比較,10ng/mL的IL-1β刺激后,自8h開始,MMP-1/-13mRNA的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)情況(P<0.05),但24h、48h、72h組比8h組MMP-
10、1/-13mRNA表達(dá)上調(diào)程度更高(P<0.05),且這三組間兩兩比較,MMP-1/-13mRNA的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。
1.3.免疫熒光染色結(jié)果
濃度為10ng/mL的IL-1β作用于hPDLCs24h后,空白對照組中MMP-1/-13均呈陽性表達(dá),實(shí)驗(yàn)組中MMP-1/-13的表達(dá)均呈強(qiáng)陽性,且多表達(dá)于胞漿內(nèi)。
1.4.MMP-1/-13蛋白的表達(dá)
選擇終濃度為10ng/mL的IL
11、-1β作用于hPDLCs24h后,MMP-1/-13蛋白表達(dá)量明顯高于空白對照組(P<0.05)。
2.MAPKs信號(hào)通路在IL-1β對hPDLCs中MMP-1/-13表達(dá)調(diào)控中的作用研究
2.1.MAPKs通路對細(xì)胞增殖的影響
在24h,各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組并無明顯差異(P>0.05);在48h,加入ERK抑制劑組OD值比IL-1β單獨(dú)作用組的OD值明顯降低,有顯著差異性(P<0.05);72h,仍以ER
12、K抑制劑組OD值最低,IL-1β作用組OD值最高,兩組比較有著顯著差異性(P<0.05)。
2.2.MAPKs通路對MMP-1/-13的表達(dá)的作用
RT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示:10ng/mL IL-1β作用組和空白對照組比較,MMP-1/-13表達(dá)均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各抑制劑組和IL-1β作用組比較,各抑制劑組MMP-1/-13表達(dá)明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<
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