Cyclin G2調(diào)控雌激素介導(dǎo)的細胞成骨分化作用及其分子機制研究.pdf

1、隨著全世界范圍內(nèi)老齡化問題的加劇，骨質(zhì)疏松癥正成為全世界各國越來越關(guān)注的重要問題。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制較為復(fù)雜，絕經(jīng)后卵巢功能衰竭所致雌激素驟減是目前公認的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要原因。雌激素通過雌激素受體依賴途徑調(diào)控間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化、抑制脂肪細胞形成、調(diào)控骨重建的平衡，但具體作用信號途徑和機理至今尚未完全清楚。
　　 雌激素受體途徑是雌激素發(fā)揮作用的重要通路，雌激素與雌激素受體結(jié)合并轉(zhuǎn)運入細胞核，激活啟動

2、子區(qū)域包含雌激素感應(yīng)元件(estrogenre responseelements，EREs)的靶基因，相應(yīng)基因表達并執(zhí)行包括調(diào)控成骨分化在內(nèi)的細胞生物學(xué)功能。周期素G2(Cyclin G2)基因的啟動子區(qū)域包含1/2 EREs位點，能夠與雌激素及雌激素受體復(fù)合物結(jié)合并抑制其mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，提示Cyclin G2可能參與了雌激素調(diào)控的某些生物學(xué)功能。Cyclin G2是一種非經(jīng)典的細胞周期素(cyclin)，具有抑制細胞周期及細胞

3、增殖的作用。本課題組發(fā)現(xiàn)Cyclin G2能夠抑制腫瘤細胞的克隆形成能力，并進一步研究證實Cyclin G2能夠在腫瘤細胞中抑制經(jīng)典Wnt信號通路活性(Wnt/β-catenin Signaling pathway)。
　　 經(jīng)典Wnt信號通路在生物的進化過程中極為保守，在細胞增殖、分化及胚胎的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。細胞外的Wnt信號分子結(jié)合到細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白，使胞內(nèi)的Dishevelled蛋白

4、被激活，抑制糖原合成激酶-3β（glycogen syntheses kinase-3β，GSK-3β）磷酸化β-catenin的能力，導(dǎo)致β-catenin不能進入泛素化途徑降解。β-catenin在細胞漿中持續(xù)累積增多到一定水平后，轉(zhuǎn)移入細胞核內(nèi)，與T細胞因子/淋巴增強因子(T-cell factor/lymphoidenhancer factor，TCF/LEF)家族結(jié)合并激活β-catenin靶基因的啟動子，從而激活CCND1、

5、C-MYC和RUNX2等經(jīng)典Wnt信號通路的下游靶基因，進一步發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin G2能夠通過與過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ)結(jié)合，啟動下游細胞成脂分化相關(guān)信號分子表達促進細胞的成脂分化，提示Cyclin G2可能參與細胞成骨的調(diào)控過程。另外，經(jīng)典Wnt信號通路對成骨和成脂的雙重調(diào)節(jié)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨量減

6、少而脂肪含量明顯升高的現(xiàn)象相一致，表明該信號通路可能在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，但目前對雌激素與經(jīng)典Wnt信號通路之間的聯(lián)系、二者是否協(xié)同作用于細胞成骨分化的調(diào)控及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展尚有待進一步證實。
　　 本研究擬在發(fā)現(xiàn)Cyclin G2抑制經(jīng)典Wnt信號通路的基礎(chǔ)上，進一步研究Cyclin G2調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的作用及分子機制;以具有成骨分化能力的C2C12細胞為研究對象，檢測Cyclin G

7、2對細胞成骨分化的調(diào)節(jié)作用并闡明其分子機制;深入分析和驗證Cyclin G2對經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控在雌激素調(diào)節(jié)細胞成骨分化過程中扮演的角色，豐富細胞周期及細胞分化調(diào)控理論，為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展與防治提供理論基礎(chǔ)。
　　 實驗材料和方法:
　　 1、成骨條件培養(yǎng)液和雌激素誘導(dǎo)細胞成骨分化過程中，CyclinG2的表達分析
　　 應(yīng)用成骨條件培養(yǎng)液添加不同濃度的雌激素誘導(dǎo)C2C12細胞成骨分化，分別誘

8、導(dǎo)48 h提取細胞總RNA和總蛋白，通過RT-PCR和Western blot方法檢測周期素G2的內(nèi)源表達水平改變;誘導(dǎo)7d裂解細胞，通過ALP活性測定試劑盒檢測細胞ALP活性變化;誘導(dǎo)14 d經(jīng)無水乙醇固定細胞，應(yīng)用茜素紅染色方法，檢測細胞鈣鹽沉積能力變化。
　　 2、成骨條件培養(yǎng)液、雌激素及Cyclin G2對細胞增殖的影響
　　 分別應(yīng)用成骨條件培養(yǎng)液添加不同濃度雌激素誘導(dǎo)C2C12細胞成骨分化或通過基因轉(zhuǎn)染在細胞

9、中過表達Cyclin G2，加藥或轉(zhuǎn)染的第0h、24 h、48 h和72h，采用CCK8方法檢測C2C12細胞增殖情況，繪制生長曲線，分析成骨條件培養(yǎng)液、雌激素對細胞增殖的影響是否依賴于Cyclin G2的作用。
　　 3、Cyclin G2過表達對細胞成骨分化能力影響的研究
　　 在C2C12細胞中通過基因轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，使細胞過表達CyclinG2。通過成骨條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)細胞成骨分化，轉(zhuǎn)染后48 h提取細胞總R

10、NA，檢測細胞成骨分化標(biāo)志(marker)基因表達水平改變;誘導(dǎo)7d裂解細胞，檢測細胞ALP活性變化;誘導(dǎo)14 d經(jīng)無水乙醇固定細胞，經(jīng)茜素紅染色檢測細胞鈣鹽沉積能力差異。
　　 4、經(jīng)典Wnt信號通路在Cyclin G2調(diào)控細胞成骨分化過程中的作用分析
　　 在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，通過RT-PCR半定量方法和Western blot方法，檢測C2C12細胞對β-catenin及其下游靶基因Runx

11、2表達的影響，通過基因轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，應(yīng)用LiCl激活細胞中經(jīng)典Wnt信號通路活性，進一步選取特定時間點檢測細胞成骨分化marker基因表達水平、ALP活性以及鈣鹽沉積能力，分析經(jīng)典Wnt信號通路在Cyclin G2調(diào)節(jié)細胞成骨分化過程中的作用。
　　 5、Cyclin G2負性調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路參與雌激素調(diào)節(jié)細胞成骨分化的研究
　　 通過基因轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染

12、在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，添加雌激素誘導(dǎo)細胞成骨分化，感染48 h提取細胞總RNA和總蛋白，通過RT-PCR和Western blot方法檢測成骨marker基因的內(nèi)源表達水平改變;誘導(dǎo)7d裂解細胞，通過ALP活性測定試劑盒檢測細胞ALP活性變化;誘導(dǎo)14 d經(jīng)無水乙醇固定細胞，應(yīng)用茜素紅染色方法，檢測細胞鈣鹽沉積能力變化。
　　 6、Cyclin G2調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路活性的作用靶點及分子機制研究

13、　　 應(yīng)用不同劑量的包裝Cyclin G2基因（CCNG2）的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染COS-7細胞，48 h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測Cyclin G2對GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及其下游靶基因的影響;在COS-7細胞中過表達Cyclin G2，應(yīng)用LiCl(40 mM)抑制GSK-3β活性，檢測LiCl對Cyclin G2調(diào)節(jié)β-catenin及其下游靶基因能力的影響，分析Cyclin G2調(diào)控經(jīng)

14、典Wnt信號通路是否需要GSK-3β的活性;通過RNA干擾方法抑制COS-7細胞中內(nèi)源Dpr1表達，Western blot方法檢測Dpr1表達抑制對Cyclin G2負調(diào)控β-catenin及其下游靶基因的影響，明確Cyclin G2負性調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的作用靶點;在COS-7細胞中過表達Cyclin G2或干擾內(nèi)源Cyclin G2表達水平，Western blot方法檢測Cyclin G2對Dvl-2蛋白的影響;并通過抑制劑

15、特異性抑制相應(yīng)蛋白降解途徑，Western blot方法檢測Cyclin G2下調(diào)Dvl-2蛋白表達作用的改變，明確Cyclin G2負性調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的級聯(lián)信號分子機制。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、Cyclin G2在體外參與雌激素誘導(dǎo)細胞成骨分化的過程
　　 通過RT-PCR半定量、Western blot及細胞成骨相關(guān)檢測方法，檢測成骨條件培養(yǎng)液與雌激素對細胞成骨分化及Cyclin G2表達的影響

16、，發(fā)現(xiàn)二者在上調(diào)C2C12細胞成骨標(biāo)志（marker）基因(Runx2，Oc，Col Ia和ALP)表達、細胞ALP活性(P＜0.001)和鈣鹽沉積能力的同時，能夠引起Cyclin G2的表達mRNA和蛋白表達水平下調(diào)，且該下調(diào)作用與雌激素劑量和細胞成骨分化水平呈正相關(guān)。
　　 2、雌激素對細胞成骨能力的調(diào)節(jié)不依賴于Cyclin G2對細胞增殖的影響
　　 通過CCK8方法選取相同時間點檢測成骨條件培養(yǎng)液、雌激素以及過表

17、達Cyclin G2對C2C12細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)成骨條件培養(yǎng)液和Cyclin G2能夠顯著抑制細胞增殖能力。添加雌激素對C2C12無明顯調(diào)節(jié)作用，表明成骨條件培養(yǎng)液和雌激素對細胞成骨分化水平與Cyclin G2抑制細胞增殖的作用無關(guān)。
　　 3、Cyclin G2負性調(diào)控細胞成骨分化能力
　　 在C2C12細胞中通過基因轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，使細胞中Cyclin G2過表達。通過成骨條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)細胞成骨分化，發(fā)現(xiàn)C

18、yclin G2過表達在C2C12細胞中能夠下調(diào)細胞成骨分化marker基因表達水平、ALP活性(P＜0.05)以及鈣鹽沉積能力，表明Cyclin G2具有抑制細胞體外成骨分化能力的作用。
　　 4、Cyclin G2通過經(jīng)典Wnt信號通路負性調(diào)控細胞成骨分化能力
　　 在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，通過RT-PCR半定量方法和Western blot方法檢測C2C12細胞對β-catenin及其下游靶基因

19、Runx2表達的影響，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2對β-catenin和Runx2的表達具有明顯的下調(diào)作用，提示Cyclin G2可能通過經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)節(jié)細胞成骨分化能力。應(yīng)用LiCl激活細胞中經(jīng)典Wnt信號通路活性，進一步檢測細胞成骨分化marker基因表達水平、ALP活性以及鈣鹽沉積能力，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2過表達抑制細胞成骨分化的能力被LiCl抑制，表明Cyclin G2通過經(jīng)典Wnt信號通路負性調(diào)控細胞成骨分化能力。
　

20、　 5、Cyclin G2抑制雌激素對細胞成骨分化的上調(diào)能力
　　 應(yīng)用雌激素誘導(dǎo)過表達Cyclin G2的C2C12細胞成骨分化，通過成骨相關(guān)檢測方法檢測細胞成骨分化水平，發(fā)現(xiàn)雌激素上調(diào)細胞成骨分化水平的能力被過表達Cyclin G2明顯抑制，表明Cyclin G2是雌激素在體外調(diào)節(jié)細胞成骨分化能力的重要因子。
　　 6、Cyclin G2調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的作用靶點和分子機制
　　 應(yīng)用不同劑量的包裝C

21、yclin G2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染COS-7細胞，檢測Cyclin G2對β-catenin及其下游靶基因的影響，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2對抑制β-catenin及其下游靶基因的作用與Cyclin G2表達呈正相關(guān);檢測Cyclin G2對p-GSK-3β表達的影響;應(yīng)用LiCl抑制GSK-3β活性，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2抑制p-GSK-3β表達，而LiCl能夠干擾Cyclin G2調(diào)節(jié)β-catenin及其下游靶基因的能力，表明該作用

22、依賴GSK-3β的活性;通過RNA干擾方法抑制COS-7細胞中內(nèi)源Dpr1表達，Western blot方法檢測Cyclin G2對β-catenin及其下游靶基因的影響，發(fā)現(xiàn)Dpr1表達水平降低引起Cyclin G2負性調(diào)控β-catenin及其下游靶基因的作用受到抑制，表明Dpr1是Cyclin G2負性調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的作用靶點;在COS-7細胞中過表達Cyclin G2或干擾內(nèi)源Cyclin G2表達水平，Western

23、blot方法檢測Cyclin G2對Dvl-2蛋白的影響，明確內(nèi)源和外源Cyclin G2均具有抑制Dvl-2蛋白表達的作用;通過抑制劑特異性抑制相應(yīng)蛋白降解途徑，Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)Cyclin G2下調(diào)Dvl-2蛋白表達的作用被MG-132抑制，表明Cyclin G2促進Dvl-2蛋白經(jīng)泛素化途徑降解。
　　 結(jié)論:
　　 1、Cyclin G2介導(dǎo)經(jīng)典Wnt信號通路負性調(diào)控細胞的成骨分化能力。