探究顆粒細胞中miR-26a-b介導雌激素調控孕酮受體的分子機制.pdf

1、排卵是雌性哺乳動物中非常重要的生理活動，而這一過程受到許多因素的協(xié)同調控，其中，由于激素調節(jié)廣泛性和容易引起級聯(lián)反應的特點被認為是排卵期主要的調控因素之一。排卵的正常發(fā)生除了要受到促卵泡激素，黃體化激素的調節(jié)，還會受到雌激素和孕酮的調節(jié)。哺乳動物體內雌激素和孕酮發(fā)揮生理作用幾乎都要與其特異性受體結合才能實現。在對孕酮受體敲除型小鼠的各項研究中發(fā)現，當孕酮受體表達異常時，可直接影響雌性哺乳動物的諸多生殖功能的正常進行，特別是在排卵這一生理

2、過程中，孕酮受體的正常表達變得十分重要。近年來，通過RNA-Seq和CHIP-Seq實驗已經篩選出了大量孕酮受體的下游基因，其中，過氧化物酶體增生激活受體γ和基質金屬蛋白酶1被認為是孕酮受體在卵巢中介導排卵過程的關鍵信號分子。此外，排卵過程中，雌激素和孕酮的血液內含量呈現一定的相關性，是否彼此調控對方的分泌尚未清楚。同時，雌激素能夠影響細胞內孕酮受體的表達已得到證實，但具體的分子機制還有待研究。
　　隨著雌性生殖研究的深入，大量研

3、究結果發(fā)現，雌激素含量變化會導致部分miRNA出現差異性表達。此外，也有實驗證實 miRNA是調控孕酮受體表達的諸多要素之一。miR-26a/b是一類常見的哺乳動物miRNA，測序數據顯示在卵泡發(fā)育期間的顆粒細胞中，miR-26a/b維持高水平表達且在卵泡發(fā)育不同時期存在表達差異，這一現象說明miR-26a/b可能作為一種重要的調節(jié)因子參與排卵過程。本實驗擬探究在排卵過程的正常進行，是否要依賴于顆粒細胞中miR-26a/b介導雌激素對孕

4、酮受體的調控作用。研究結果顯示，在小鼠原代顆粒細胞中，經雌激素處理24h后，通過RT-PCR檢測pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表達量都顯著下調（p≤0.05），此外，通過RT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現孕酮受體及其下游基因過氧化物酶體增生激活受體γ和基質金屬蛋白酶1的mRNA和蛋白表達均發(fā)生顯著上調。通過生物信息學分析miRNA調控孕酮受體3’-UTR序列的靶位點序列，構建

5、雙熒光報告載體以及位點突變載體。熒光數據顯示，miR-26a/b可特異性結合到孕酮受體3’-UTR序列，并引起蛋白水平的下調。為了進一步證實miR-26a/b可介導雌激素對孕酮受體表達的調控，實驗選取了人顆粒細胞系（KGN）作為實驗對象。KGN細胞在經雌激素處理24h之后，細胞內pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表達量都顯著下調（p≤0.05），此外，孕酮受體及其下游基因過氧化物酶體增生激活

6、受體γ和基質金屬蛋白酶1的mRNA和蛋白表達均發(fā)生顯著上調，結果與小鼠原代顆粒細胞處理組一致。通過采用雌激素受體拮抗劑，它莫西芬和雌激素受體干擾RNA，shER阻斷雌激素信號通路，結果顯示，細胞內pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表達量都顯著上調（p≤0.05），同時孕酮受體及下游基因在mRNA和蛋白水平顯著下調。為了進一步證實miR-26a/b對于下游基因的調控，實驗中采用miR-26a/

7、b minics和miR-26a/b inhibitors分別處理KGN細胞，結果顯示，miRNA minics處理后，孕酮受體及下游基因的表達受到阻遏；當用miRNA inhibitors處理細胞后，孕酮受體及下游基因的表達發(fā)生顯著性上調趨勢。為更加精確模擬miRNA在細胞內的成熟過程，實驗通過構建pre-miR-26a/b表達載體以實現miRNA在細胞中長期穩(wěn)定表達。瞬時轉染miRNA表達載體，可抑制雌激素對孕酮受體的調控。