miR--26b調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡機制.pdf

1、miRNAs是一種長度約為22-25nt的小非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。miR-26b是目前研究較多的一個miRNA，廣泛參與細胞增殖、凋亡、分化、遷移和自噬等多種細胞過程的調(diào)控。在豬卵巢組織中，實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-26b在卵泡閉鎖過程中表達上調(diào)，促進卵泡顆粒細胞凋亡。目前豬miR-26b前體特征尚不清楚，其調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡的機制研究也較少。本文通過克隆獲得了豬miR-26b前體序列，利用生物信息學方法分析

2、了其序列與結(jié)構(gòu)特征;利用生物信息學方法預(yù)測和試驗驗證miR-26b在豬卵泡顆粒細胞凋亡中的作用;利用生物信息學方法和多種試驗技術(shù)鑒定miR-26b的靶基因，并分析了miR-26b調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡的信號通路，為解析miR-26b調(diào)控豬卵泡閉鎖和顆粒細胞凋亡機制提供依據(jù)。
　　本文研究結(jié)果主要包括以下幾個方面:
　　1、豬miR-26b前體的克隆和序列分析
　　以豬基因組DNA為模板，通過擴增測序獲得85bp豬miR

3、-26b前體序列，同源性比對發(fā)現(xiàn)豬miR-26b前體序列與哺乳動物其它物種高度保守。哺乳動物miR-26b成熟序列高度一致，與斑馬魚和海七鰓鰻相比，也僅在11位核苷酸處出現(xiàn)U-C突變。脊椎動物miR-26b種子序列均為UCAAGUA。RNAfold軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)豬miR-26b的二級結(jié)構(gòu)為典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，另外還含有四個不對稱的突起，這可能與其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究結(jié)果表明哺乳動物miR-26b高度保守，推測miR-26b的功能在哺乳動物

4、中具有相似性。
　　miRNA主要通過靶基因發(fā)揮作用，KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)miR-26b的靶基因主要富集在凋亡、PI3K-Akt、FoxO和TGF-β等信號通路中，其中凋亡相關(guān)通路富集的靶基因最多，提示miR-26b可能是一個凋亡相關(guān)的miRNA。體外試驗發(fā)現(xiàn)在豬卵泡顆粒細胞中過表達miR-26b后，顆粒細胞凋亡率顯著增加，且可顯著抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，表明miR-26b可促進豬卵泡顆粒細胞凋亡，是豬卵泡顆粒

5、細胞中的促凋亡因子。
　　2、miR-26b通過靶向USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡
　　生物信息學分析發(fā)現(xiàn)USP9X是miR-26b的一個候選靶基因。熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)miR-26b顯著抑制USP9X-3'UTR熒光素酶載體活性，但對突變型USP9X-3'UTR熒光素酶載體活性無影響，表明miR-26b可與USP9X基因3'UTR直接結(jié)合并抑制USP9X的表達。在體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細胞中過表達mi-26b可極顯著降低U

6、SP9X基因mRNA和蛋白水平，說明mi-26b可靶向抑制豬卵泡顆粒細胞中USP9X的表達。敲減USP9X可極顯著增加豬卵泡顆粒細胞凋亡率，顯著增加促凋亡基因Bax和降低抗凋亡基因Bcl-2表達水平，說明USP9X可以抑制豬卵泡顆粒細胞凋亡。另外，將miR-26b inhibitor和USP9X-siRNA共轉(zhuǎn)體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)豬卵泡顆粒細胞凋亡率顯著增加，說明miR-26b可通過靶向抑制USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡。<

7、br>　　前人研究發(fā)現(xiàn)Samd4是USP9X的下游基因，USP9X可通過去泛素化減少SMAD4蛋白的降解來增強其生物學功能。本文進一步分析了USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡的機制。敲減USP9X后豬卵泡顆粒細胞中SMAD4基因mRNA表達水平無顯著變化，而SMAD4蛋白水平顯著降低，表明USP9X可促進豬卵泡顆粒細胞中SMAD4蛋白表達。過表達SMAD4可促進豬卵泡顆粒細增殖，敲減SMAD4則可促進顆粒細胞凋亡。而過表達或者抑制miR-

8、26b，可分別顯著抑制或者促進豬卵泡顆粒細胞中SMAD4的表達，表明miR-26b可通過USP9X-SMAD4軸調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡。同時，TGF-β/SMAD信號通路中的配體TGF-β1也參與了豬卵泡顆粒細胞中miR-26b-USP9X-SMAD4信號通路的調(diào)控。另外，我們發(fā)現(xiàn)在豬CYP19A1基因啟動子區(qū)存在SBE（SMAD結(jié)合位點），熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)，過表達或者敲減SMAD4后可促進或者抑制CYP19A1基因啟動子活性。過表

9、達SMAD4可促進豬卵泡顆粒細胞中CYP19A1表達和雌激素合成。綜上所述，miR-26可通過靶向抑制USP9X-SMAD4-CYP19A1通路中USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡的通路。
　　3、miR-26b通過靶向HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡
　　實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-26b可通過靶向HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡。本文首先利用生物信息學方法、點突變和熒光素酶報告系統(tǒng)，進一步證實miR-26b可與HAS2基因3'U

10、TR直接結(jié)合抑制HAS2的表達。qRT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn)HAS2基因mRNA和蛋白在豬健康卵泡中的表達水平分別顯著或極顯著高于閉鎖卵泡，表明HAS2可能參與了豬卵泡閉鎖的調(diào)控。敲減HAS2可顯著增加豬卵泡顆粒細胞凋亡，而過表達HAS2則顯著降低豬卵泡顆粒細胞凋亡，表明HAS2可抑制豬卵泡顆粒細胞凋亡。另外，將miR-26b inhibitor和HAS2-siRNA共轉(zhuǎn)體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)豬卵泡顆粒細胞凋亡顯

11、著增加，說明miR-26b可通過靶向抑制HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡。
　　HAS2是HA合成的關(guān)鍵酶，而HA是通過激活CD44和抑制Caspase-3的表達來抑制卵泡顆粒細胞凋亡的。本文進一步分析了miR-26b通過HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡的通路。敲減HAS2可極顯著降低豬卵泡顆粒細胞培養(yǎng)液中HA的濃度和CD44基因表達，激活Caspase-3基因表達，與抑制miR-26b對HA-CD44-Caspase-3通路的影響相

12、反;敲減HAS2可抑制miR-26b inhibitor對HA-CD44-Caspase-3通路的調(diào)控，表明miR-26b可通過HAS2調(diào)控下游通路HA-CD44-Caspase-3。外源添加HA可顯著影響豬卵泡顆粒細胞中CD44和Caspase-3基因表達，顯著降低顆粒細胞凋亡率，并可挽救HAS2-siRNA和miR-26b引起的顆粒細胞凋亡，說明miR-26b可通過HAS2-HA-CD44-Caspase-3通路來調(diào)控豬卵泡顆粒細胞

13、凋亡。
　　綜上所述，本文獲得了豬miR-26b前體基因序列，進一步證實其是豬卵泡顆粒細胞中的促凋亡因子。USP9X和HAS2是豬卵泡顆粒細胞中miR-26b的直接靶基因，miR-26b可通過USP9X-SMAD4-CYP19A1信號通路和HAS2-HA-CD44-Caspase-3信號通路調(diào)控豬卵泡顆粒細凋亡。因此，本文發(fā)現(xiàn)了兩個新的調(diào)控豬卵泡閉鎖和卵泡顆粒細胞凋亡的信號通路: miR-26b-USP9X-SMAD4-CYP19