細(xì)胞因子誘導(dǎo)肝細(xì)胞定向分化作用及丙戊酸提高分化率的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是屬于中胚層的一類(lèi)多能干細(xì)胞,主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富,其能夠分化為成骨、軟骨和脂肪,為原始造血干/祖細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中的生長(zhǎng)和分化提供支持。近年研究發(fā)現(xiàn),MSCs具有較高的分化潛能,甚至可以跨越分化為其他胚層來(lái)源的細(xì)胞,MSCs跨越分化肝細(xì)胞已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究重點(diǎn)研究小鼠肝臟損傷條件培養(yǎng)液中誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(m

2、BMSSCs)向肝細(xì)胞分化的細(xì)胞因子,及組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑丙戊酸(VPA)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSSCs)向肝細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。
　　 第一部分:三種細(xì)胞因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化作用的研究
　　 目的:了解肝損傷條件培養(yǎng)液中FGF-4、HGF和OSM對(duì)mBMSSCs定向分化肝細(xì)胞的作用。
　　 方法：用成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)mBMSSCs向成骨和脂肪細(xì)胞分化。檢測(cè)肝損傷小

3、鼠損傷不同時(shí)間點(diǎn)肝臟和肝損傷條件培養(yǎng)液中FGF-4、HGF和OSM的動(dòng)態(tài)表達(dá)。用相應(yīng)抗體封閉條件培養(yǎng)液中的FGF-4、HGF和OSM因子作為實(shí)驗(yàn)組,未封閉組作為對(duì)照組,誘導(dǎo)mBMSSCs向肝細(xì)胞分化。RT-PCR檢測(cè)CK19、ALB、CK18和TAT的mRNA表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)AFP和ALB的蛋白表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞ALB分泌水平；PAS反應(yīng)檢測(cè)分化細(xì)胞的糖原合成能力。
　　 結(jié)果：成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液能夠誘導(dǎo)mBMSSCs分化為

4、成骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液能誘導(dǎo)mBMSSCs分化為脂肪細(xì)胞。小鼠肝臟損傷后FGF-4、HGF和OSM的mRNA及蛋白表達(dá)水平均比正常組高。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,分化第10dCK18和分化第20dTAT mRNA的表達(dá)在對(duì)照組檢測(cè)到,而實(shí)驗(yàn)組未檢測(cè)到；免疫熒光檢測(cè)分化第10dAFP和分化第20dALB蛋白低表達(dá)；ELISA檢測(cè)分化20d時(shí)ALB蛋白分泌量明顯降低；PAS反應(yīng)檢測(cè)糖原合成陽(yáng)性率降低。
　　 結(jié)論：抗體封閉肝損傷條件培養(yǎng)

5、液中FGF-4、HGF和OSM,可明顯抑制mBMSSCs向肝細(xì)胞的定向分化,提示FGF-4、HGF和OSM是誘導(dǎo)mBMSSCs向肝細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子。
　　 第二部分:丙戊酸提高細(xì)胞因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化率的研究
　　 目的:研究組蛋白去乙?；敢种苿┍焖?valproic acid,VPA)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stromal stem cells,hBMSSCs

6、)向肝細(xì)胞分化的影響。
　　 方法：利用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)篩選的方法分離成年健康志愿者骨髓中的hBMSSCs。將分離得到的hBMSSCs用5mM的VPA預(yù)處理72h后,按照特定的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子組合誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞分化,未加VPA處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。誘導(dǎo)分化過(guò)程中,通過(guò)對(duì)VPA預(yù)處理組和未處理組細(xì)胞形態(tài)、分子和細(xì)胞功能檢測(cè),比較兩組細(xì)胞的分化程度。利用免疫熒光染色和westernblot方法檢測(cè)組蛋白H3和H4的乙?；?。

7、
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比,經(jīng)VPA預(yù)處理的hBMSSCs,細(xì)胞因子誘導(dǎo)后能分化出形態(tài)更均一的肝樣細(xì)胞,肝細(xì)胞標(biāo)志性基因(AFP、ALB的mRNA和蛋白)表達(dá)水平更高。VPA處理后能明顯提高分化細(xì)胞的肝細(xì)胞功能,表現(xiàn)在糖原合成,細(xì)胞色素P450活性和細(xì)胞尿素生成能力增強(qiáng)。5 mM VPA處理72 h后,細(xì)胞組蛋白H3和H4的乙酰化水平與處理前比,明顯提高。
　　 結(jié)論：VPA能夠提高h(yuǎn)BMSSCs分化肝細(xì)胞的效率,其機(jī)理