丙戊酸鈉誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖分化及凋亡的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 染色體組蛋白N端乙?；接山M蛋白乙?；?HAT)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)動(dòng)態(tài)調(diào)控，其可影響組蛋白與DNA的親和性而改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)，從而影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列的結(jié)合，對(duì)基因表達(dá)調(diào)控具有類似DNA遺傳密碼的作用。組蛋白乙?；且豢赡娴膭?dòng)態(tài)過程，組蛋白去乙?；憩F(xiàn)的基因轉(zhuǎn)錄沉默，與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有密切的關(guān)聯(lián)。這就為腫瘤治療提供了一個(gè)新的思路--增強(qiáng)HAT表達(dá)和/或降低HDACs表達(dá)。丙戊酸鈉(VPA-Na)

2、廣泛應(yīng)用于抗癲癇臨床治療，一直以其低毒高效著稱，近期研究證實(shí)其是HDAC的特異性抑制劑之一，本文應(yīng)用VPA-Na干預(yù)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖周期變化以確定其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用和量效關(guān)系；檢測(cè)分析Caspase3、Caspase8、Caspase9活性及蛋白表達(dá)變化，Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21<'Waf/cip1>蛋白及mRNA表達(dá)水平的

3、變化，并探討了其效應(yīng)機(jī)制。 方法： VPA-Na對(duì)乳腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響將乳腺癌細(xì)胞以臺(tái)盼蘭染色，加入終濃度0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)設(shè)不加藥僅加等量PBS的對(duì)照組，適當(dāng)條件培養(yǎng)，于藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)取樣，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 VPA-Na對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響(1)細(xì)胞增殖檢測(cè)將終濃度

4、分別為0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L，的VPA-Na加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，另設(shè)不加藥僅加等量PBS的試驗(yàn)對(duì)照組和僅加RPMl1640完全培養(yǎng)液的試劑空白對(duì)照，適當(dāng)條件培養(yǎng)，于藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)取樣處理，以MTT比色法測(cè)吸收度，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)將濃度分別為0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、

5、3.0mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na，加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，另設(shè)不加藥僅加等量PBS的對(duì)照組，適當(dāng)培養(yǎng)，于藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)取樣處理，以流式細(xì)胞術(shù)法分析。(3)細(xì)胞周期分析將濃度分別為0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，同時(shí)設(shè)不加藥僅加等量PBS的對(duì)照組，適當(dāng)培養(yǎng)，于藥物處理不同時(shí)間取樣處理，以流式細(xì)胞術(shù)法分析細(xì)胞周期。 VPA-

6、Na對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制(1)Caspase活性與蛋白表達(dá)檢測(cè)將終濃度1.5mmol/L、3.0mmol/L的VPA-Na加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，并設(shè)不加藥僅加等量PBS的對(duì)照組，適當(dāng)培養(yǎng)，以酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，計(jì)算Caspase活化值；以FACs分析，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度指數(shù)表示蛋白表達(dá)量。(2)Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21<'Waf/cip1>蛋白與mRNA表達(dá)分析將終濃度1.5mmol/L、3.0mmo

7、l/L的VPA-Na加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，并設(shè)不加藥僅加等量PBS的對(duì)照組，適當(dāng)培養(yǎng)，以FACs分析，并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度指數(shù)表示蛋白表達(dá)量，以PCR法測(cè)定mRNA的量。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.0軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ANNOVA檢驗(yàn)、PEARSON相關(guān)檢驗(yàn)。 結(jié)果： VPA-Na對(duì)乳腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響丙戊酸鈉能明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，藥物作用后出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞大小、形態(tài)不均、細(xì)胞核固

8、縮、胞漿減少、胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，死細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。 VPA-Na對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響(1)細(xì)胞增殖檢測(cè)0.75～4.0 mmol/L VPA-Na作用24、48、72、96h后，各試驗(yàn)組均出現(xiàn)了不同的生長(zhǎng)抑制且呈逐漸升高趨勢(shì)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)0.75～4.0 mmol/L，VPA-Na作用24、48、72、96h后，各試驗(yàn)組均出現(xiàn)了不同程度的凋亡增加，最低藥物濃度作

9、用24h細(xì)胞凋亡率為6.2％，最高藥物濃度作用96h凋亡率為28.8％，較對(duì)照組凋亡率(4.0％～6.0％)顯著升高(p<0.001)。(3)細(xì)胞周期分析0.75～4.0 mmol/L VPA-Na作用24、48、72、96h后，對(duì)照組的細(xì)胞增殖周期G1、S、M期所占比例未見明顯改變，而實(shí)驗(yàn)組則隨藥物濃度、作用時(shí)間的不同而出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞增殖周期G1期阻滯，G1期比例由56.4％～78.9％不等，與對(duì)照組比較，其升高有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

10、p<0.001)。 VPA-Na對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制分子機(jī)制研究證實(shí)，在VPA-Na干預(yù)后Caspase3活性明顯升高、蛋白表達(dá)被顯著上調(diào)，其中在3.0mmol/L VPA-Na干預(yù)48h后Caspase3活性增加106％，Caspase3蛋白平均熒光強(qiáng)度指數(shù)(MFI)為5.34，與對(duì)照組比較均顯著升高(p<0.001)；Caspase9活性及蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與Caspase3基本相同；而Caspase8活性及蛋白表達(dá)在VPA.N

11、a作用后未見明顯改變。VPA-Na干預(yù)乳腺癌細(xì)胞48h后，Cyclin D1蛋白表達(dá)被明顯下調(diào)而P21<'Waf/cip1>蛋白表達(dá)被明顯上調(diào)，與對(duì)照組Cyclin D1、P21<'War/tip1>蛋白表達(dá)比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)；CyelinA、Cyclin E蛋白表達(dá)變化未見明顯差異(p>0.05)； mRNA水平，與1.5mmol/L 、3.0mmol/L 丙戊酸鈉共同作用48h后，CyelinD1 mRNA

12、表達(dá)也被下調(diào)而P21<'Waf/cip1>mRNA表達(dá)則被明顯上調(diào)(p<0.001)；Cyelin A mRNA、Cyclin E mRNA表達(dá)水平則同樣未見明顯變化(p>0.05)。 結(jié)論： 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，丙戊酸鈉可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡并且造成細(xì)胞增殖周期G1期阻滯。在其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，Caspase9介導(dǎo)的細(xì)胞色素C凋亡途徑被激活，起到了誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵作用，而Caspase8介導(dǎo)的凋亡受體途徑在

13、此過程中并不占主導(dǎo)地位。丙戊酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞增殖周期G1期阻滯可能通過下列途徑分別和/或協(xié)同實(shí)現(xiàn)：①上調(diào)P21<'Waf/cip1> mRNA及P21<'Waf/cip1>蛋白表達(dá)，與Cyclins競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDKs，廣泛的抑制各種Cyelin-CDK復(fù)合物，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期，②下調(diào)Cyclin D1 mRNA、Cyelin D1蛋白表達(dá)，降低CyclinD1-CDK4/CDK6通路活性，造成細(xì)胞增殖不能越過G1期限制點(diǎn)。因此，0