2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:揭示沙蟾毒精誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機制,為沙蟾毒精的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供實驗基礎(chǔ),并研究YAP(Yes-associated protein)在沙蟾毒精誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡中的角色,為揭示YAP在細(xì)胞凋亡中的作用提供研究實例。
  方法:(1)采用MTT法評價沙蟾毒精對乳腺癌細(xì)胞體外增殖抑制作用。(2)構(gòu)建MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型,評價沙蟾毒精的體內(nèi)抗腫瘤活性。(3)采用免疫組化法檢測 MDA-MB-231裸鼠

2、移植瘤腫瘤組織中細(xì)胞增殖活力和凋亡情況。(4)運用TUNEL熒光染色法和Annexin V-PI雙染法檢測沙蟾毒精誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用。(5)采用免疫熒光法和免疫印跡法檢測沙蟾毒精處理前后YAP的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)的分布情況。(6)通過siRNA技術(shù)沉默YAP和 Lats1在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)。(7)采用免疫印跡法分析凋亡相關(guān)蛋白以及MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。(8)運用免疫共沉淀法和免疫印跡法分析檢測堿性磷酸酶處理前

3、后對YAP在凝膠中的遷移運動的影響,以及用SP600125(JNK抑制劑),SB203580(p38抑制劑),U0126(MEK抑制劑)預(yù)處理乳腺癌細(xì)胞對沙蟾毒精導(dǎo)致的YAP遷移滯后的影響。(9)運用Annexin V-PI雙染法、免疫印跡法和實時定量PCR分別檢測了SP600125預(yù)處理MCF-7細(xì)胞對沙蟾毒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、凋亡蛋白表達(dá)水平和凋亡基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。(10)染色質(zhì)免疫沉淀分析YAP與凋亡基因的結(jié)合。
  結(jié)果:

4、(1)沙蟾毒精在體內(nèi)外都具有良好的抗乳腺癌活性,能抑制乳腺癌移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞的增殖活力,并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,實驗結(jié)果還顯示沙蟾毒精在體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡具有時間和劑量依賴性。(2)共聚焦實驗和免疫印跡法結(jié)果顯示,沙蟾毒精能夠促進YAP從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi),同時觀察到Y(jié)AP電泳條帶出現(xiàn)遷移(3)siRNA YAP預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)沙蟾毒精誘導(dǎo)的凋亡(4)經(jīng)堿性磷酸酶處理后,沙蟾毒精引起的YAP遷移滯后現(xiàn)象被抑制,說明YAP遷移滯后是由蛋白

5、磷酸化修飾造成的。進一步觀察發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精可導(dǎo)致YAP促凋亡活性位點Tyr537被磷酸化。(5)使用SP600125(JNK抑制劑),SB203580(p38抑制劑)和U0126(MEK抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)只有JNK的抑制劑能逆轉(zhuǎn)沙蟾毒精誘導(dǎo)的YAP遷移滯后和磷酸化現(xiàn)象,說明JNK參與YAP磷酸化的調(diào)控;(6)結(jié)合免疫共沉淀和染色質(zhì)共沉淀實驗結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)YAP入核后與p73的結(jié)合能力顯著增強,同時YAP與凋亡基因Bax的啟動子結(jié)合增

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