利用T7噬菌體cDNA文庫篩選登革2型病毒與白紋伊蚊相互作用基因.pdf

1、目的：
　　 1.從白紋伊蚊體內(nèi)提取總RNA，分離純化出mRNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA并將其轉(zhuǎn)入T7噬菌體，利用T7噬菌體構(gòu)建白紋伊蚊cDNA文庫，并鑒定文庫是否符合文庫構(gòu)建標準。
　　 2.培養(yǎng)C6/36細胞，利用C6/36細胞擴增登革2型病毒，并將登革2型病毒進行純化，測量病毒滴度，檢測純化后病毒與登革2型特異性抗體的結(jié)合能力。
　　 3.利用上述構(gòu)建的白紋伊蚊T7噬菌體cDNA文庫與分離純化的登革2型病毒，

2、通過蛋白分子雜交的方法，篩選出白紋伊蚊與登革2型病毒相互作用的相關(guān)因子的基因，并將篩選出的基因進行生物信息學分析。
　　 方法：
　　 1.利用T7噬菌體構(gòu)建白紋伊蚊cDNA文庫：首先分離純化出白紋伊蚊的mRNA;所得的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，在雙鏈cDNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ接頭使其兩端分別帶EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端；然后用MiniColumn純化收集300bp以上的雙鏈cDNA片段，連

3、接于T7Select10-3b載體；經(jīng)體外包裝后，以BLT5403為受主菌株構(gòu)建T7噬菌體展示cDNA文庫。對從原始文庫中隨機挑取的50個噬菌斑進行PCR鑒定重組率。將構(gòu)建成功的cDNA文庫進行擴增，濃縮并保存。
　　 2.純化登革2型病毒：采用登革2型病毒的中間受主C6/36細胞來增殖病毒。通過分析登革2型病毒對C6/36細胞感染和復制的情況，確定收獲高滴度病毒的最佳時間段，然后通過大量的感染來增殖病毒。獲得大量登革2型病毒液

4、，然后反復凍融，使增殖的登革病毒從感染的C6/36細胞中釋放出來。采用PEG-8000進行濃縮，將濃縮病毒重懸，用30％的蔗糖墊底進行超速離心，將病毒純化。將純化的病毒進行滴度測試和病毒感染性檢測。
　　 3.篩選與登革2型病毒相互作用的白紋伊蚊作用因子：應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)。以純化的登革2型病毒作為靶分子，通過蛋白分子雜交的方法，對T7噬菌體白紋伊蚊cDNA文庫進行多輪生物篩選，對篩選到的陽性克隆進行測序，將測序得到的DNA序列

5、進行分析及同源性搜索
　　 結(jié)果：
　　 1.本文所構(gòu)建的白紋伊蚊cDNA文庫在重組率、文庫庫容量和文庫的均一性方面均符合文庫構(gòu)建的基本要求。此文庫的庫容量經(jīng)測定為1.7×107pfu/mL，擴增后文庫滴度為2.5×1013pfu/mL，濃縮后的文庫滴度為2.13×1015pfu/mL。重組率為95％以上；陽性克隆片段長度分布在200bp至2000bp，其中有90％的插入片段大于300bp。均符合構(gòu)建文庫的庫容量在1.0

6、×106以上，構(gòu)建文庫的庫容量在90％以上且大于300bp，文庫的均一的標準。本文成功構(gòu)建的白紋伊蚊cDNA文庫，為后續(xù)的蟲媒病毒相關(guān)受體的研究提供了充足的材料。
　　 2.C6/36細胞在感染病毒5天后出現(xiàn)細胞皺縮、變形，繼而出現(xiàn)多細胞融合形成的巨細胞，7-8天左右出現(xiàn)大量細胞破碎。在細胞發(fā)生融合時，將其于-20℃凍存。獲得大量的登革病毒液后，將所得的病毒液純化，純化后的登革2型病毒的滴度為TCID50=10-3.875。純化

7、的登革2型病毒通過SDS-PAGE分析，加入登革一抗可以看到明顯的條帶。所得到的登革2型純化病毒的滴度和SDS-PAGE的結(jié)果分析均表示其具有很強的感染能力，這可以為相關(guān)實驗提供足夠感染能力的病毒。
　　 3.通過將所構(gòu)建的白紋伊蚊cDNA文庫和所純化的登革2型病毒相互作用，多次淘洗得到2個陽性克隆。將其測序后，其測序結(jié)果在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索和比對(BLAST)，發(fā)現(xiàn)這兩個陽性克隆分別與埃及伊蚊的唾液腺上的基

8、因序列和埃及伊蚊的mRNA降解蛋白質(zhì)的部分基因的序列具有很高的同源性，同源性分別達到81％和90％。因埃及伊蚊與白紋伊蚊的同源性很高，同為傳播登革病毒的重要蚊蟲媒介。因此，此結(jié)果可以確定是能與登革2型病毒相互作用的蛋白，其中一段基因位于蚊蟲唾液腺上，這與許多研究蚊蟲登革病毒受體的工作人員得到的結(jié)果一致，但是重新從分子生物學的角度得到了有力證據(jù)，以前的研究大部分停留在蛋白的階段。同時也發(fā)現(xiàn)mRNA降解蛋白質(zhì)(NMD)與白紋伊蚊感染傳播登革

9、2型病毒有可能存在一定的關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.本文構(gòu)建了白紋伊蚊T7噬菌體展示cDNA文庫，構(gòu)建的文庫滿足生物分子學文庫的基本標準，可以用于篩選白紋伊蚊與相關(guān)蚊蟲病毒相互作用基因的研究。同時，為后續(xù)研究白紋伊蚊與登革病毒相互作用機制和蚊蟲傳播蟲媒病毒的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，提供了充足的研究材料。而且從分子生物學的角度來看，這對蟲媒病毒的傳播有了更深刻地研究。
　　 2.本文用此方法純化的登革2型病毒的滴度

10、符合后續(xù)篩選要求,將純化的登革2型病毒進行病毒滴度測試，此病毒滴度的登革2型病毒的感染力基本符合要求；通過用SDS-PAGE的方法分析此方法純化的登革2型病毒，可以看到在目的條帶處有明顯的條帶，說明所純化的登革2型病毒具有感染力。
　　 3.本文使用的T7噬菌體展示技術(shù)是篩選相互作用因子基因的一種簡單、快速和有效的手段。篩選到的相互作用因子的基因為進一步探討白紋伊蚊與登革2型病毒感染機制提供了重要的依據(jù)；對媒介蚊蟲對登革病毒易感