酵母雙雜交文庫構(gòu)建與TMEFF2相互作用蛋白篩選.pdf

1、TMEFF2（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains）基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因，目前對其功能研究還較少。本實驗室通過構(gòu)建單側(cè)視網(wǎng)膜摘除的鴿模型，用消減抑制雜交法建立了鴿左前腦的cDNA差異表達(dá)文庫，并且通過反Northern雜交篩選出一些差異表達(dá)的EST片段。我們從中選取了一條EST片段，通過RACE法成功的克隆了其全長

2、基因，且經(jīng)同源性比較證實為TMEFF2基因。為了探究TMEFF2基因的功能，我們將其EGF樣功能域作為酵母雙雜交的“誘餌”，對正常人腦cDNA文庫進(jìn)行篩選，經(jīng)DNA序列測定證實為Celsr2、G3BP2、agrin、prosaposin等，因此初步確定TMEFF2基因與神經(jīng)發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。 為了更進(jìn)一步探究TMEFF2的功能和作用機(jī)理，本文首先構(gòu)建了TMEFF2基因胞內(nèi)域的酵母雙雜交“誘餌”表達(dá)載體，經(jīng)驗證無自激活現(xiàn)象并且對

3、酵母菌株無明顯毒性，western印跡對蛋白表達(dá)的定性分析顯示目的蛋白表達(dá)正確；其次利用酵母體內(nèi)能夠發(fā)生高頻率同源重組的特點(diǎn)，采用CLONTECH SMART（Switching Mechanism at5'end of RNA Transcript）技術(shù)，以人腦總RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄和長距離PCR構(gòu)建了酵母雙雜交cDNA文庫；最后以CLONTECH MATCHMAKER SYSTEM3為操作平臺，利用融合的方法對自行構(gòu)建的人腦cD

4、NA文庫進(jìn)行篩選，最終得到一個與人ryanodine receptor2（RYR2）同源的基因和一個未知基因（Homo sapiens mRNA；cDNA DKF2p686C06106），由此推測TMEFF2基因胞內(nèi)域中潛在的G蛋白激活模序可能與Ca2+或者酪氨酸蛋白激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。 此外，在克隆TMEFF2基因全長cDNA的過程中，我們還意外地發(fā)現(xiàn)了一個新的TMEFF2剪接體序列。序列測定和分析表明，該剪接體缺失的