酵母雙雜交篩選與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì).pdf

1、目的:前期工作中以改良的錨定消減雜交技術構(gòu)建了大鼠脊髓全橫斷模型的差異表達cDNA文庫，經(jīng)點雜交排除假陽性和半定量PCR驗證，從中篩選到一批差異表達EST序列。其中的新基因Scirr1編碼蛋白具有“F-box+LRR”結(jié)構(gòu)域，稱為Fbxl16（又稱SCIRR1）。Fbxl16是急性脊髓損傷后高調(diào)表達的新蛋白之一，本文目的在于尋找體內(nèi)能夠與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì),用以揭示該蛋白的功能及其在脊髓損傷修復過程中的作用，以期通過該蛋白的研

2、究尋找促進損傷脊髓修復的藥物靶標。
　　方法:制作大鼠脊髓全橫斷損傷模型，提取損傷段脊髓總RNA；通過RT-PCR技術克隆新Scirr1的編碼區(qū)序列；測序正確后，將該基因的EST序列構(gòu)建入載體pSos的多克隆位點構(gòu)建質(zhì)粒pSos-scirr1；酵母雙雜交預實驗明確系統(tǒng)效率、排除pSos空載體對RAS系統(tǒng)的自激活活性；把該重組質(zhì)粒表達的融合蛋白hSos-Fbxl16作為誘餌蛋白,以改良的酵母雙雜交技術篩選大鼠腦cDNA文庫，篩選出能

3、夠與Fbxl16假定陽性相互作用的蛋白質(zhì)；最后用酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實驗對獲得的假定相互作用的可靠性加以驗證。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了融合蛋白表達質(zhì)粒pSos-scirr1之后,篩選出了11個與Fbxl16假定陽性相互作用的蛋白質(zhì)；通過回轉(zhuǎn)實驗驗證,確定其中兩個蛋白能與Fbxl16相互作用,兩者分別是cAMP依賴蛋白激酶α型催化亞基（proteinkinase,cAMP-dependent,catalytic,alpha；Prkaca)和

4、衣被蛋白復合物ζ亞基（coatomer protein complex,subunit zeta1；Copz1).
　　結(jié)論:Prkaca作為cAMP依賴蛋白激酶α型催化亞基,是體內(nèi)該酶催化亞基的主要存在形式。Prkaca與Fbxl16相互作用的發(fā)現(xiàn)是關注的要點，它和脊髓損傷有關，其傳導通路cAMP依賴蛋白激酶傳導通路（PKA）在脊髓損傷修復中表現(xiàn)出重要意義。
　　脊髓損傷后中樞受損時，相應外周感覺神經(jīng)元損傷后不能再生。在腰

5、髓背根神經(jīng)節(jié)微量注射膜通透cAMP類似物能夠促進受損的中樞神經(jīng)再生；刺激cAMP信號通路能夠提升受損的感覺神經(jīng)元的內(nèi)在的生長能力。
　　神經(jīng)營養(yǎng)因子能增加神經(jīng)元的cAMP水平，激活PKA通路，繼而阻斷鞘磷脂相關糖蛋白對脊髓損傷后神經(jīng)元再生的抑制。
　　在脊髓損傷局部和大腦運動皮層給入cAMP能誘導大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生。
　　細胞移植和cAMP聯(lián)合治療脊髓損傷再生已經(jīng)受到許多學者的關注。cAMP亦能介導調(diào)控BDNF水平

6、。
　　所以，脊髓損傷修復相關蛋白Fbxl16和蛋白激酶A催化亞基PKAC-alpha相互作用的發(fā)現(xiàn)無疑為解釋cAMP通路與脊髓損傷的關系，進而為闡明脊髓損傷的分子機理帶來新的思路，也為脊髓損傷治療的藥物干預提供新的方向。
　　細胞內(nèi)膜系統(tǒng)各個部分之間的物質(zhì)傳遞常常通過膜泡運輸方式進行。衣被蛋白（coatomer protein complex）是一種構(gòu)成運輸膜泡表面衣被的蛋白復合體。它們具有兩個主要作用：①選擇性的將特定蛋

7、白聚集在一起，形成運輸小泡；②如同模具一樣決定運輸小泡的外部特征，相同性質(zhì)的運輸小泡之所以具有相同的形狀和體積，與衣被蛋白的組成有關。已知三類具有代表性的衣被蛋白，即：籠形蛋白（clathrin）、COPI和COPII，各自介導不同的運輸途徑。Copz1是衣被蛋白I（coatomer protein complexI，COPI）的組成蛋白，COPI是一種構(gòu)成運輸膜泡表面衣被的蛋白復合體，負責從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜泡運輸。Copz1與Fb