酵母雙雜交篩選stratifin在結(jié)腸癌干細(xì)胞中相互作用的蛋白質(zhì).pdf

1、後旦大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼：10246學(xué)號(hào)：10211280010(專(zhuān)業(yè)學(xué)位)酵母雙雜交篩選stratifin在結(jié)腸癌干細(xì)胞中相互作用的蛋白質(zhì)ScreeningfortheproteinsinteractingwithStratifininhumancoloncancerstemcellsbyyeasttwohybridassays系：復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué))名：宓林師：于曉峰教授導(dǎo)師組成員：鄒健副主任完成日期：20

2、13年4月15Et院專(zhuān)姓導(dǎo)復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文酵母雙雜交篩選stratifin在結(jié)腸癌干細(xì)胞中相互作用的蛋白質(zhì)中文摘要背景我們?cè)谇捌谘芯恐型ㄟ^(guò)比較親代結(jié)腸癌SWlll6細(xì)胞株和結(jié)腸癌干細(xì)胞株(SWlll6csc)之間的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)其中Stratifin具有顯著差異。本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究Stratifin在人結(jié)腸癌干細(xì)胞中相互作用的蛋白。材料方法人結(jié)腸癌干細(xì)胞株(SWlll6csc)是本課題組前期從SWlll6細(xì)胞株中分離出并傳代培養(yǎng)

3、。我們應(yīng)用CLONTECH酵母雙雜交系統(tǒng)(MATCHMAKERGAL4TwoHybridSystem3)，提取SWll16csc中的細(xì)胞總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成eDNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHIOB并構(gòu)建eDNA初級(jí)文庫(kù)，與pGADT7進(jìn)行重組形成AD質(zhì)粒。將Stratifin基因利用經(jīng)PCR引入的SfiI酶切位點(diǎn)定向克隆至pGBKT7，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，構(gòu)建BD質(zhì)粒pGBKT7一SFN，并用卡那霉素篩選相應(yīng)陽(yáng)性克隆，通過(guò)酶切提取質(zhì)粒鑒

4、定插入片段的大小。將序列正確的文庫(kù)質(zhì)粒pGADT7一SWlll6csc及誘餌質(zhì)粒pGBKT7SFN共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AHl09，檢測(cè)誘餌質(zhì)粒有無(wú)毒性作用及自激活功能。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人結(jié)腸癌干細(xì)胞eDNA文庫(kù)中與Strafitin相互作用的蛋白，篩選出His3幾acZ／Ade2陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行DNA測(cè)序和BLAST比對(duì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建的pGADT7一SWI116csc文庫(kù)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)片段長(zhǎng)度約15Kbp左右，pGBKT

5、7一SFN經(jīng)SfiI酶切后產(chǎn)生1OKbp以上大小的片段，均與理論擴(kuò)增大小一致。將酵母雙雜交系統(tǒng)中的重組誘餌載體pGBKT7一SFN與人結(jié)腸癌干細(xì)胞cDNA文庫(kù)質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AHl09，報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果顯示其不具有毒性及自激活效應(yīng)。利用酵母雙雜交的方法篩選出了7個(gè)與Stratifin蛋白相互作用的His3／LacZ／Ade2陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)DNA測(cè)序和BLAST比對(duì)得共到了4種相關(guān)蛋白：BAD、MPRIP、CHRM】7、T