應(yīng)用酵母雙雜交體系篩選FXR1P相互作用蛋白.pdf

1、目的:應(yīng)用酵母雙雜交體系篩選人胎腦cDNA文庫(kù)中與脆性X智力低下相關(guān)蛋白1(FXR1P)相互作用的蛋白質(zhì),進(jìn)而了解FXR1P的功能,推測(cè)FXR1P與脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。
　　方法:(1)將FXR1基因亞克隆進(jìn)酵母雙雜交系統(tǒng)中的pGBKT7載體,得到誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1,轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,檢測(cè)融合蛋白對(duì)報(bào)告基因LacZ的自激活作用及對(duì)酵母菌的毒性;(2)轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH109與轉(zhuǎn)

2、化了人胎腦cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的酵母細(xì)胞Y187進(jìn)行交配,利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和β-半乳糖苷酶濾膜分析交配混合物中報(bào)告基因ADE2、HIS3、LacZ的表達(dá),篩選陽(yáng)性克隆;(3)提取陽(yáng)性克隆酵母中的質(zhì)粒DNA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,利用含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基篩選AD-Library質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子,提取AD-Library質(zhì)粒,進(jìn)行酶切和歸類;(4)AD-Library質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌Y187,與轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH

3、109進(jìn)行交配,驗(yàn)證蛋白質(zhì)的相互作用;(5)真陽(yáng)性克隆的AD-Library質(zhì)粒測(cè)序及同源性分析。
　　結(jié)果:(1)酶切和測(cè)序鑒定誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-FXR1構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,融合蛋白對(duì)報(bào)告基因LacZ無(wú)自激活作用,且對(duì)酵母菌無(wú)毒性;(2)通過文庫(kù)篩選得到77個(gè)陽(yáng)性克隆;(3)AD-Library質(zhì)粒酶切后歸類獲得15組不同克隆;(4)再次驗(yàn)證結(jié)果仍為陽(yáng)性的克隆有10個(gè);(5)測(cè)序結(jié)果生物學(xué)信息分析表明,7個(gè)為非