酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人DND1相互作用蛋白.pdf

1、目的:本課題研究的目的是在正常人腦cDNA文庫中通過酵母雙雜交技術(shù)篩選與人DND1相互作用的蛋白質(zhì)，并對篩選出的蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)功能初步分析，為進(jìn)一步研究人DND1的功能及信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)以人dnd1cDNA為模板用PCR的方法擴(kuò)增人dnd1目的基因，目的片段和重組質(zhì)粒行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建人DND1蛋白的酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pDBleu-dnd1，測序比對結(jié)果匹配后檢驗(yàn)其毒性和自激活性，同時(shí)擴(kuò)增正常人

2、腦cDNA文庫，為下一步進(jìn)行DND1蛋白的相互作用蛋白篩選及相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ);
　　(2)在正常人腦cDNA文庫中，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與人DND1相互作用的蛋白，得到的陽性克隆質(zhì)粒行雙酶切及測序鑒定;(3)用共轉(zhuǎn)化法將誘餌質(zhì)粒pDBleu-dnd1和陽性克隆質(zhì)粒回轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中進(jìn)一步驗(yàn)證;(4)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證陽性克隆質(zhì)粒提取后行測序及同源性分析。
　　結(jié)果:(1)構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pDBleu-dnd1，并通過檢

3、測證實(shí)構(gòu)建的重組質(zhì)粒對酵母菌無毒性，無自激活性;(2)應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)以及生物信息學(xué)分析，我們在正常人腦組織的cDNA文庫中篩選出四個(gè)與人DND1有相互作用的蛋白質(zhì)，分別為GRN，F(xiàn)LAD1，EFEMP1，RNF31。通過酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗(yàn)證及NCBI數(shù)據(jù)庫中blast分析，排除酵母蛋白干擾、實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陰性、假陽性，比對DNA序列100％匹配。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建用于酵母雙雜交技術(shù)篩選的誘餌質(zhì)粒pDBLeu-Dnd1;(2)